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真菌作为天然产物的重要来源,其抗氧化活性物质的研究已经显示出广阔的发展前景。本文以食用菌作为研究对象,围绕其抗氧化活性物质的分离纯化、构效关系及抗氧化机制进行研究。
首先,通过测定抑制红细胞溶血活性的方法对37种食用菌进行筛选,确定将鲍鱼菇(Pleurotus abalonus)子实体作为抗氧化活性的研究对象。然后通过水提醇沉、DEAE纤维素阴离子交换和Sephadex G-200分子筛凝胶层析分离到两个具有抗氧化活性的样品,定名为LA和LB,LA为纯多糖,分子量约为120KD。将LB利用Affi blue gel亲和吸附层析进一步分离到LB-1、LB-2和LB-3。将具有抗氧化活性的LB-1利用Superdex75分子筛凝胶层析分离得到LB-1a和LB-1b。LB-1b为多糖蛋白复合物(polysaccharide-protein complex,PPC),分子量约16KD,其蛋白含量为53.04%,糖含量为45.25%,具有显著的抗氧化活性。
通过对核磁共振(NMR),信号进行分析,推测LA的主链一级结构为[-〉6)-α-D-Glcp-(1->]n吡喃型葡萄糖,LB-1b主链一级结构为[-)4)-β-D-Glcp-(1-〉]n吡喃型葡萄糖;通过高压液相色谱(HPLC)分析确定LA单糖组成为葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖和阿拉伯糖,LB-1b单糖组成为葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖;利用β-消去反应发现N-糖苷键是LB-1b中蛋白质和多糖的连接方式;通过氨基酸自动分析仪确定LB-1b中含有17种氨基酸,其中8种为人体必需;利用Edman降解法,确定LB-1b N端氨基酸序列为:IPKERKEFQQAQHLK。结果显示本研究从真菌中分离到了一个新化学结构、高生物活性的多糖蛋白复合物。
构效关系的研究表明,由于LA和LB-1b的黏度、分子量、溶解度及糖链结构的不同,造成其生物活性之间的差别;LB-1b中含有的脯氨酸、组氨酸、蛋氨酸和酪氨酸均被认为具有较强的抗氧化活性,可在体内被水解后发挥作用;将LB-1b的蛋白部分与现已报道的抗氧化蛋白通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)进行序列比对,结果发现其N端氨基酸序列之间有一定的相似度,推测LB-1b的蛋白部分在抗氧化活性中起着重要的作用。研究揭示了真菌中多糖(LA)及多糖蛋白复合物(LB-1b)的抗氧化构效关系,为开发一种天然、高效、低毒的大分子生物药物奠定了理论基础。
在体外实验中,LA对1,1-二苯基-2-间三硝苯基-肼基(DPPH)自由基的清除率达到了77.4%,抑制人类免疫缺陷病毒(HIV-1)反转录酶的活性达60.51%;LB-1b对红细胞溶血的抑制率为93.02%,对红细胞超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)酶活的提高率为47.29%,对乳腺癌细胞(MCF7)抑制率为84.4%。
在体内实验中,通过对半乳糖造模衰老小鼠和快速衰老小鼠(SAM)组织的抗氧化酶活性及丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量进行测定,确定九月龄SAM为研究天然产物抗氧化机制的最适动物模型。寿命追踪实验表明LB-1b可以显著提高SAM的寿命;九月龄SAM经LB-1b处理后,SOD、过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)的活性均明显提高,其中CAT在不同组织中的活性均提高50%以上;而MDA含量均下降20%以上;实时定量PCR(real-time quantitative PCR.)结果表明,肝脏中三种抗氧化酶的基因表达水平均显著提高。
综合体外和体内实验结果,推断多糖蛋白复合物LB-1b是通过提高抗氧化酶基因表达水平增加酶量、提高酶活性,从而加强了对活性氧的清除作用;通过清除活性氧不仅保护了体内的抗氧化酶和小分子抗氧化物质,而且抑制了自由基的链式反应,减轻了对生物膜的损伤,从而降低了膜的脂质过氧化程度。本研究对真菌中大分子物质抗氧化作用机制的阐明为首次报道。