【摘 要】
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鳞翅目夜蛾科害虫甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)是一类危害极其严重、抗性上升较快的世界性害虫.已有的研究结果表明Cry1Ca蛋白的结构域(Domain)Ⅲ决定晶体蛋白对甜菜夜蛾的特
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鳞翅目夜蛾科害虫甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)是一类危害极其严重、抗性上升较快的世界性害虫.已有的研究结果表明Cry1Ca蛋白的结构域(Domain)Ⅲ决定晶体蛋白对甜菜夜蛾的特异性,因此,在研究和确定Cry1Aa与Cry1Ca蛋白对甜菜夜蛾协同杀虫作用的基础上,利用同源重组技术进行Cry1Aa和Cry1C之间的Domain替换,可望获得高效的融合蛋白,为甜菜夜蛾等夜蛾科害虫的控制提供工程菌株.cry1Aa基因和cry1C基因分别来源于质粒pMPCV1和pMPCV2.pMPCV1和pMPCV2经SphI和SmaI双酶切后,分别回收含cry1Aa基因和cry1C基因的片断,再连接到穿梭载体pBU4上,得到含cry1Aa和cry1C基因的重组质粒pCX1A和pCX1C.将pCX1A和pCX1C电激转入苏云金杆菌无晶体型菌株4Q-7(cry-)中分别获得转重组菌株Bt-pCX1A和Bt-pCX1C.重组菌株在LB培养基上生长发育良好,能在芽孢形成过程中产生伴胞晶体.SDS-PAGE表明cry1Aa基因和cry1C基因在重组菌株中获得了表达,分别检测到135kDa和130kDa的蛋白带.表达Cry1Aa、Cry1C蛋白的重组菌株Bt-pCX1A,Bt-pCX1C的单一发酵液和两者以不同比例混合的混合物对甜菜夜蛾和棉铃虫的生物测定表明,Cry1Aa对棉铃虫具有特异性毒杀作用,LC<,50>值为0.338mg/ml,Cry1C对甜菜夜蛾有中毒力,LC50值为1.466mg/ml.Cry1Aa和Cry1 C以1:1,1;5,5:1的比例混合时,对甜菜夜蛾和棉铃虫都有协同作用.其中以1:1的比例混合后的协同作用最为明显,其对甜菜夜蛾的LC<,50>为0.537mg/ml,对棉铃虫的LC<,50>为0.204 mg/ml.同时,该文成功利用点突变的方法分别在cry1Aa基因和cry1C基因的结构域Ⅰ和结构域Ⅱ之间突变产生新的XhoI酶切位点,得到突变后的菌株E-pCR1AM和E-pCR1CM,利用SphI和XhoI双酶切突变质粒pCR1AM和pCR1CM,分别获得含有编码Cry1Aa Domain Ⅰ和Cry1C Domain Ⅱ和Ⅲ片段(ACC),编码Cry1C Domain Ⅰ和Cry1Aa Domain Ⅱ和Ⅲ片段(CAA)两个同源重组基因,但重组基因的特性分析及其表达有待进一步研究.初步结果将为研究Cry蛋白的不同结构域的结构与功能的关系和筛选高效的融合蛋白奠定基础.
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