论文部分内容阅读
金龟子绿僵菌是一种分布广泛的土壤习居真菌，可以感染大约200种昆虫和某些节肢动物，但对哺乳动物没有侵染性。因此，绿僵菌已经被开发为一种重要的植物有害昆虫防治资源。本论文利用番茄与植物病原物互作体系，探究了绿僵菌对根结线虫(Meloidogyne incognita)引起的根结线虫病和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病的生物防治潜力。此外，对绿僵菌的生防机制进行了研究。主要研究结果如下：
1.金龟子绿僵菌可以寄生根结线虫。南方根结线虫是重要的世界性分布土传植物病原线虫，可以侵染许多蔬菜和大田作物。但是对环境友好的根结线虫防治方法有限。本论文探究了金龟子绿僵菌菌株IBCCM321.93对南方根结线虫引起的线虫病害防控潜力。通过扫描电镜和透射电镜观察，及利用绿色荧光标记的绿僵菌侵染线虫的卵，都表明绿僵菌可以寄生线虫的卵。此外，显微镜观察表明绿僵菌还可以寄生线虫的成熟雌虫。与水对照相比，1×108/ml绿僵菌孢子在处理线虫卵8天后，对卵孵化的抑制率可达75%。
2.金龟子绿僵菌的代谢产物具有杀根结线虫活性。绿僵菌的发酵滤液可以显著降低卵的孵化率，并对二龄幼虫(J2)具有致死性。其中95%浓度的发酵滤液在处理卵11天后，对卵的孵化抑制率达97.6%，对J2处理12h后可导致100%的J2致死率。此外，浓度为95%的发酵滤液于100℃处理15min后，用其处理二龄幼虫12h，对线虫的致死率仍有97.68%。
3.金龟子绿僵菌可以在植物的根部定殖，并促进植株的生长。用荧光标记的绿僵菌接种番茄幼苗后，用激光共聚焦显微镜在番茄的根部可以观察到定殖的绿僵菌。此外，通过PCR检测及分离根部真菌的方法也证明了绿僵菌可以定殖在植物根部。根部定殖的绿僵菌，可以显著促进番茄的生长。与水对照相比，绿僵菌处理4周后的番茄株高，在盆栽试验和温室大棚试验中分别提高约1.95倍和1.26倍。
4.金龟子绿僵菌具有开发为防治根结线虫病的有益微生物制剂的潜力。通过盆栽试验，表明在番茄的根部周围每克土壤施用1×108个绿僵菌孢子，可以减少约48%-54%根结，49%-58.3%卵块数，56%-61%根部线虫卵的数量，和54%-62%土壤中J2数量。在自然发生根结线虫病的温室大棚中施用绿僵菌，绿僵菌对根结线虫病有较好的生防效果。与水处理对照相比，被线虫侵染的番茄经绿僵菌处理后，番茄根结数减少16.6%，每株根部的卵数减少22.78%。除此之外，绿僵菌的发酵液也可以明显减轻线虫的危害，先接种发酵液再接种线虫有约60%防病效果，先接种线虫再接种发酵液则有35%防治效果。
5.利用RNA-seq解析金龟子绿僵菌寄生根结线虫卵的分子机制。分析绿僵菌寄生线虫12h及24h后明显上调或下调的基因。结果表明，与丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸型内肽酶活性和丝氨酸型水解酶活性相关的基因被显著富集，暗示丝氨酸肽酶在侵染线虫卵的早期发挥作用。此外，可能与绿僵菌识别和粘附线虫卵的过程相关的凝集素、细胞壁蛋白、细胞外膜蛋白相关的基因在12hpi和24hpi均上调。此外，G蛋白α亚基、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和蛋白激酶相关基因在24h时明显上调表达，暗示MAPK信号通路可能参与了寄生过程。几丁质酶、转运蛋白、CYPs(细胞色素P450)和次级代谢物相关基因在12hpi和24hpi也表现明显上调表达，推测这些基因可能也参与了侵染线虫卵的过程。分析发现有3个附着胞形成相关基因在12h时上调表达，8个基因在24h时上调表达，据此推测12h可能是金龟子绿僵菌识别和粘附线虫卵的阶段，而24h是穿透卵壳侵入卵的阶段。此外，氧化还原酶活性基因、信号转导和转运相关基因明显富集，该特点与淡紫紫孢菌侵染线虫的卵时基因表达模式一致，表明两种寄生真菌可能存在相同的侵染模式。
6.金龟子绿僵菌对灰霉病有较好的防治效果。灰霉病是由灰葡萄孢引起的植物病害，可造成严重的经济损失，本论文分析了绿僵菌防治灰霉病的能力。绿僵菌对灰葡萄孢有拮抗性，二者对峙培养时产生约6.25mm的拮抗带。绿僵菌10%浓度的发酵滤液对灰葡萄孢的菌丝生长抑制率达88.62%，对菌核萌发抑制率达63.85%。绿僵菌2%浓度的发酵滤液或125μg/ml的发酵滤液粗提液，均能完全抑制灰葡萄孢孢子萌发。此外，绿僵菌产生的挥发性物质可以抑制灰葡萄孢的生长。绿僵菌发酵液具有耐热性，在100℃下加热15min后仍能抑制灰葡萄孢的生长。探讨绿僵菌抑制灰葡萄孢的机制，发现绿僵菌发酵滤液导致灰葡萄孢菌丝稀疏、扭曲，产生的分生孢子形态异常，灰葡萄孢的菌丝细胞内的细胞器结构被严重破坏，且分生孢子中的膜系统受到破坏。离体试验表明绿僵菌发酵滤液对番茄叶片和果实灰霉病的防治效果分别为57.35%和50%；而活体植株试验时对番茄叶片和果实灰霉病的防治效果分别为54.98%和10%。因此，绿僵菌具有抗真菌能力，可以明显减少灰霉病的危害。
综上所述，绿僵菌对根结线虫病和灰霉病都表现出较好的防治效果。绿僵菌也是已知的重要昆虫寄生真菌。因此，绿僵菌在联合防控线虫病害、真菌病害和虫害有较好的潜力。此外，本研究探究了绿僵菌的生防机理，筛选出了绿僵菌中寄生线虫相关基因，有助于提高其生防能力。该研究拓宽了绿僵菌的应用范围，对深入开发和利用绿僵菌具有一定的指导意义。
1.金龟子绿僵菌可以寄生根结线虫。南方根结线虫是重要的世界性分布土传植物病原线虫，可以侵染许多蔬菜和大田作物。但是对环境友好的根结线虫防治方法有限。本论文探究了金龟子绿僵菌菌株IBCCM321.93对南方根结线虫引起的线虫病害防控潜力。通过扫描电镜和透射电镜观察，及利用绿色荧光标记的绿僵菌侵染线虫的卵，都表明绿僵菌可以寄生线虫的卵。此外，显微镜观察表明绿僵菌还可以寄生线虫的成熟雌虫。与水对照相比，1×108/ml绿僵菌孢子在处理线虫卵8天后，对卵孵化的抑制率可达75%。
2.金龟子绿僵菌的代谢产物具有杀根结线虫活性。绿僵菌的发酵滤液可以显著降低卵的孵化率，并对二龄幼虫(J2)具有致死性。其中95%浓度的发酵滤液在处理卵11天后，对卵的孵化抑制率达97.6%，对J2处理12h后可导致100%的J2致死率。此外，浓度为95%的发酵滤液于100℃处理15min后，用其处理二龄幼虫12h，对线虫的致死率仍有97.68%。
3.金龟子绿僵菌可以在植物的根部定殖，并促进植株的生长。用荧光标记的绿僵菌接种番茄幼苗后，用激光共聚焦显微镜在番茄的根部可以观察到定殖的绿僵菌。此外，通过PCR检测及分离根部真菌的方法也证明了绿僵菌可以定殖在植物根部。根部定殖的绿僵菌，可以显著促进番茄的生长。与水对照相比，绿僵菌处理4周后的番茄株高，在盆栽试验和温室大棚试验中分别提高约1.95倍和1.26倍。
4.金龟子绿僵菌具有开发为防治根结线虫病的有益微生物制剂的潜力。通过盆栽试验，表明在番茄的根部周围每克土壤施用1×108个绿僵菌孢子，可以减少约48%-54%根结，49%-58.3%卵块数，56%-61%根部线虫卵的数量，和54%-62%土壤中J2数量。在自然发生根结线虫病的温室大棚中施用绿僵菌，绿僵菌对根结线虫病有较好的生防效果。与水处理对照相比，被线虫侵染的番茄经绿僵菌处理后，番茄根结数减少16.6%，每株根部的卵数减少22.78%。除此之外，绿僵菌的发酵液也可以明显减轻线虫的危害，先接种发酵液再接种线虫有约60%防病效果，先接种线虫再接种发酵液则有35%防治效果。
5.利用RNA-seq解析金龟子绿僵菌寄生根结线虫卵的分子机制。分析绿僵菌寄生线虫12h及24h后明显上调或下调的基因。结果表明，与丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸型内肽酶活性和丝氨酸型水解酶活性相关的基因被显著富集，暗示丝氨酸肽酶在侵染线虫卵的早期发挥作用。此外，可能与绿僵菌识别和粘附线虫卵的过程相关的凝集素、细胞壁蛋白、细胞外膜蛋白相关的基因在12hpi和24hpi均上调。此外，G蛋白α亚基、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和蛋白激酶相关基因在24h时明显上调表达，暗示MAPK信号通路可能参与了寄生过程。几丁质酶、转运蛋白、CYPs(细胞色素P450)和次级代谢物相关基因在12hpi和24hpi也表现明显上调表达，推测这些基因可能也参与了侵染线虫卵的过程。分析发现有3个附着胞形成相关基因在12h时上调表达，8个基因在24h时上调表达，据此推测12h可能是金龟子绿僵菌识别和粘附线虫卵的阶段，而24h是穿透卵壳侵入卵的阶段。此外，氧化还原酶活性基因、信号转导和转运相关基因明显富集，该特点与淡紫紫孢菌侵染线虫的卵时基因表达模式一致，表明两种寄生真菌可能存在相同的侵染模式。
6.金龟子绿僵菌对灰霉病有较好的防治效果。灰霉病是由灰葡萄孢引起的植物病害，可造成严重的经济损失，本论文分析了绿僵菌防治灰霉病的能力。绿僵菌对灰葡萄孢有拮抗性，二者对峙培养时产生约6.25mm的拮抗带。绿僵菌10%浓度的发酵滤液对灰葡萄孢的菌丝生长抑制率达88.62%，对菌核萌发抑制率达63.85%。绿僵菌2%浓度的发酵滤液或125μg/ml的发酵滤液粗提液，均能完全抑制灰葡萄孢孢子萌发。此外，绿僵菌产生的挥发性物质可以抑制灰葡萄孢的生长。绿僵菌发酵液具有耐热性，在100℃下加热15min后仍能抑制灰葡萄孢的生长。探讨绿僵菌抑制灰葡萄孢的机制，发现绿僵菌发酵滤液导致灰葡萄孢菌丝稀疏、扭曲，产生的分生孢子形态异常，灰葡萄孢的菌丝细胞内的细胞器结构被严重破坏，且分生孢子中的膜系统受到破坏。离体试验表明绿僵菌发酵滤液对番茄叶片和果实灰霉病的防治效果分别为57.35%和50%；而活体植株试验时对番茄叶片和果实灰霉病的防治效果分别为54.98%和10%。因此，绿僵菌具有抗真菌能力，可以明显减少灰霉病的危害。
综上所述，绿僵菌对根结线虫病和灰霉病都表现出较好的防治效果。绿僵菌也是已知的重要昆虫寄生真菌。因此，绿僵菌在联合防控线虫病害、真菌病害和虫害有较好的潜力。此外，本研究探究了绿僵菌的生防机理，筛选出了绿僵菌中寄生线虫相关基因，有助于提高其生防能力。该研究拓宽了绿僵菌的应用范围，对深入开发和利用绿僵菌具有一定的指导意义。