中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国所特有的淡水养殖经济品种,在水产养殖行业中占有重要地位。但各种细菌、病毒、真菌及寄生虫性疾病的暴发给中华绒螯蟹的养殖带来极大的威胁,是制约该行业发展的主要因素之一。过去,传统的抗生素的治疗和预防措施带来严重的副作用,包括抗药性增加、品质下降以及环境日益污染等。为了推行健康养殖的理念,我们检测了育肥饲料中植物油和虾青素的含量对中华绒螯蟹抗病力和免疫力以及肠道菌群的影响,以期获得最适的添加量。本文通过5组(0、25%、50%、75%和100%)不同植物油替代鱼油比例饲料投喂后的中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的抗病能力、免疫性能的变化和体内微生物多样性的研究,及5组(0、26.60、41.62、75.35和81.37 mg/kg)不同虾青素含量饲料投喂后的中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的抗病能力、免疫性能的变化及体内可培养优势细菌数量和组成的研究,说明饲料中不同含量的油脂成分和虾青素对提高中华绒螯蟹抗病力、免疫性能的影响,并结合对体内微生物多样性的研究,以期为中华绒螯蟹的健康养殖提供一定的理论依据。1投喂5组不同植物油替代鱼油比例的饲料影响育肥期中华绒螯蟹雄蟹、雌蟹对嗜水气单胞菌的抗病能力,且其对二者的影响不同。高鱼油含量有助于提高雄蟹抗病力。其中,全鱼油组存活率最高为37.5%,而25%~75%植物油替代鱼油组次之,为12.5%,当100%植物油替代鱼油时存活率为0。对雌性中华绒螯蟹而言,高植物油含量有助于提高其抗病力。75%和100%植物油替代鱼油组的存活率分别为20%和40%,较0%和50%植物油替代鱼油组的10%的存活率高10%~30%。组织病理分析结果显示,与健康对照组相比,在嗜水气单胞菌攻毒致死的雄蟹中,25%植物油替代鱼油组的肝胰腺和鳃组织的病理损伤不明显,其他各组均有不同程度的肝细胞脱落和鳃上皮细胞溶解,其中全植物油组肝胰腺和鳃的病理损伤最为严重,肝胰腺肝小管变形,细胞严重空泡化,肝小管腔内出现大量脱落的细胞,鳃上皮细胞溶解,有些部位只剩下几丁质的空腔,鳃丝间隙有大量杂质和污物附着。而雌蟹中75%和100%植物油替代鱼油组,肝胰腺和鳃组织的病理损伤不明显;0%和50%植物油替代鱼油组,肝小管腔内出现大量脱落的细胞,空泡化严重,伴随鳃组织的上皮细胞加厚或萎缩,角质膜不同程度隆起,鳃叶腔扩大,鳃丝排列紊乱,鳃丝间有污物附着。在对非特异性免疫指标酸性磷酸酶(acidphosphatase,acp)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,alp)和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)的测定中发现,投喂5组饲料能够显著影响育肥期雄蟹血清和性腺中alp的活性,25%植物油替代鱼油组显著降低了血清和性腺中alp的活性(p<0.05),而对acp和sod没有显著性影响,同时,全鱼油组显著降低了雌蟹血清中sod和肝胰腺中acp的活性,而75%植物油替代鱼油和全植物油组显著提高了雌蟹血清中sod和肝胰腺中acp的活性(p<0.05)。通过对非特异性免疫相关的基因的荧光定量分析发现,25%和75%植物油替代鱼油能够不同程度地提高了雄蟹肝胰腺中髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor,myd88)、脂肪酸结合蛋白(fattybindingprotein3,fabp3)、sod、溶菌酶(lysozyme,lzm)的相对表达量,且50%植物油替代鱼油能够显著提高肝胰腺中hc的相对表达量(p<0.05)。75%和100%植物油替代鱼油组,雌蟹血细胞中myd88的相对表达量较其他组显著提高(p<0.05)。通过第二代高通量测序技术(nextgenerationsequencingtechnology),对5组饲料投喂后的中华绒螯蟹的前肠、后肠、鳃和养殖水体内微生物进行16srrnav4区扩增,经illumina平台高通量测序(high-throughputsequencing)发现,中华绒螯蟹雌蟹和雄蟹体内微生物的组成相似,前肠中主要的优势菌门为柔膜菌门(tenericutes)、厚壁菌门(firmicutes)、tm7、拟杆菌门(bacteroidetes)、变形菌门(proteobacteria)。后肠中为柔膜菌门、厚壁菌门、tm7、拟杆菌门、变形菌门5个已分类门和相当部分的未分类门。鳃中为酸杆菌门(acidobacteria)、放线菌门(actinobacteria)、tm7、拟杆菌门、变形菌门5个已分类菌门和部分未分类菌门。养殖水体中为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、绿弯菌门(chloroflexi)、蓝细菌(cyanobacteria)、thermi、疣微菌门(verrucomicrobia)、tm7和酸杆菌门。5组饲料对中华绒螯蟹体内微生物菌群的组成影响不大,但对物种丰度的影响较大。2投喂5组不同虾青素含量的饲料影响育肥期雄性中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的抗病力,且虾青素含量为41.62和75.35mg/kg的饲料组存活率最高,均为42%。通过对非特异性免疫相关的基因myd88、caspase和sod的荧光定量分析发现,26.60和75.35mg/kg的虾青素饲料能够降低血细胞中myd88、caspase和SOD的相对表达量(P<0.05),并使肝胰腺中MyD88、Caspase和SOD的相对表达量降低。利用基础培养基和选择性培养基对其肠道、鳃及养殖水体中的细菌进行分离和纯化,并结合16S rRNA基因同源性分析发现,在分离获得的106株细菌(登录号:KU570293~KU570368,KU570370,KU570372~KU570383,KU601302~KU601316,KU720553)中,92株为优势菌株,其中,肠道、鳃部和水体各29、32和31株。肠道中的可培养优势菌属为柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和气单胞菌属(Aeromonas),且B组(26.26 mg/kg)肠道内可培养细菌总数最高(1.06×108 cfu/g);E组(75.35 mg/kg)肠道中的潜在致病菌数量显著降低(P<0.05)。鳃中可培养优势菌属为柠檬酸杆菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属和气单胞菌属,E组(75.35 mg/kg)肠道内可培养细菌总数显著高于其他四组(P<0.05)。养殖水体中可培养优势菌属为芽孢杆菌属、气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、假单胞菌属和黄杆菌属(Chryseobacterium),虾青素的添加对各组的可培养细菌数量无显著影响。研究表明,饲料中添加不同含量的虾青素能够显著的影响中华绒螯蟹雄性个体肠道和鳃中的菌群构成,且虾青素含量为41.26 mg/kg时,肠道和鳃中潜在致病菌数量所占比例较高。综上所述,本论文研究了育肥饲料中不同植物油替代鱼油比例和虾青素含量对中华绒螯蟹抗病力、免疫力以及肠道菌群的影响,为生产实践中确定其合适的添加量有理论指导意义,对今后益生菌的应用及健康养殖具有重要贡献。