【摘 要】
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解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一种经美国FDA认证的安全菌株。众所周知,微生物及其次级代谢产物胞外多糖（exopolysaccharides,EPS）具有许多益生功能,其中之一是通过维持肠道稳态来缓解溃疡性结肠炎。目前对解淀粉芽孢杆菌的研究主要集中于抗菌肽和酶制剂等,较少涉及该菌胞外多糖的益生作用及其相关机制,更没有涉及到对溃疡性结肠炎的缓解作用。首先,本
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（31771908）; 广州市科技计划资助项目（201903010015）
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解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一种经美国FDA认证的安全菌株。众所周知,微生物及其次级代谢产物胞外多糖（exopolysaccharides,EPS）具有许多益生功能,其中之一是通过维持肠道稳态来缓解溃疡性结肠炎。目前对解淀粉芽孢杆菌的研究主要集中于抗菌肽和酶制剂等,较少涉及该菌胞外多糖的益生作用及其相关机制,更没有涉及到对溃疡性结肠炎的缓解作用。首先,本论文从中国云南普洱茶中筛选得到解淀粉芽孢杆菌DMBA-K4,并进行鉴定和安全性评价;优化了此菌产胞外多糖的培养成分和发酵条件,并评价粗多糖的抗氧化能力;其次,从粗多糖分离纯化得到EPS-K4,利用紫外、红外光谱、凝胶渗透色谱和气/液相质谱等,解析多糖EPS-K4化学结构;最后,通过动物实验,探究EPS-K4在缓解溃疡性结肠炎的作用和相关机制,旨在为防治溃疡性结肠炎开发出一种新型免疫刺激剂提供理论依据。从中国云南普洱茶中分离出1株产EPS的菌株,经16S r DNA鉴定并结合其生理生化特性,确定为解淀粉芽孢杆菌DMBA-K4,经过小鼠急性经口毒性试验证明其属安全无毒级菌株。利用单因素和响应面实验优化该菌EPS的产量,并对其体外抗氧化活性进行研究。经优化后,DMBA-K4产EPS的最优营养成分和发酵条件是:4 g/L蔗糖、5 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取粉、5 g/L Na Cl;培养时间18 h、p H7.6、接种量3.10%。在此优化条件下,EPS产量为171.31 mg/L,提高了155.7%。当EPS浓度为5 mg/m L时,DPPH自由基清除率达78.60%,·OH的清除率达75.47%,表明DMBA-K4所产的EPS具有较好的抗氧化活性。通过离子交换色谱法和凝胶渗透色谱法分离纯化得到多糖EPS-K4,其重均分子量为10 067 Da,单糖成分为甘露糖、葡萄糖、果糖和半乳糖醛酸（摩尔比为85.25∶8.40∶3.25∶2.39）。样品在220 nm波长下有紫外吸收峰。EPS-K4红外光谱表现出明显的碳水化合物吸收峰,该多糖具有C-H、C=O、-OH、C-O-H和C-O-C等官能团。EPS-K4的主链是→6)-β-Glcp-（1→2）-β-Glcp-（1→2）-α-Manp-（1→6）-β-Manp-（2→β-Manp-T,而支链是→6）-α-Manp-（1→,且连接于→2,6）-β-D-Glcp-(1→的C6位置。扫描电镜结果表明EPS-K4呈不规则的光滑片状结构,表面有大小不一的孔洞。通过结肠炎小鼠模型,从肠道菌群、炎性症状和肠道屏障等方面探究了多糖EPS-K4干预溃疡性结肠炎的作用和机制。结果表明,肠球菌（Enterococcus）和大肠杆菌-志贺氏菌（Escherichia-Shigella）等致病菌丰度均显著受到EPS-K4抑制。乳酸菌（Lactobacillus）丰度和肠道菌群多样性、丰富度增加。EPS-K4可促进杯状细胞分泌黏蛋白,维持肠道屏障的完整性,降低血清中毒性物质内毒素、二胺氧化酶和D-乳酸的水平,实验小鼠血清中促炎细胞因子TNF-α减少50.96%,抑炎细胞因子IL-10水平提高49.54%。综上所述,从中国云南普洱茶中筛选得到的解淀粉芽孢杆菌DMBA-K4是安全无毒的菌株。经优化后,此菌EPS产量为171.31 mg/L,该粗多糖有较好的抗氧化活性。分离纯化后的EPS-K4以甘露糖和葡萄糖主链,且在恢复溃疡性结肠炎小鼠的肠道菌群、炎性症状和肠道屏障方面有积极影响。以上表明菌株DMBA-K4及其多糖EPS-K4在防治溃疡性结肠炎有潜在的价值和应用前景。本论文为EPS-K4作为一种新型的缓解溃疡性结肠炎的免疫刺激剂提供了数据支撑,为解淀粉芽孢杆菌及其胞外多糖在食品、药品中的应用提供了理论依据和补充。
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