甾醇14-去甲基化酶(CYP51)是N末端结构域缺乏膜结合的水溶性蛋白质,位于真核生物内质网和线粒体内膜上,参与多种内源性物质和外源性生物制剂的核心代谢过程。同时,CYP51也是细胞色素P450酶真核生物生长繁殖等生命过程中不可缺少的酶,降低低等真核生物体内天然CYP51的水平可使生物体的生存和繁殖急剧减少,从而导致细胞死亡,而这种情况又可通过添加CYP51的量进行逆转。同时,CYP51在生物体内以加氧激活的形式参与甾醇类物质合成等途径,而甾醇是合成生物活性分子的前体,对细胞膜的构建十分重要,该酶活性丧失可直接导致麦角甾醇合成受阻、细胞膜形态改变以及膜渗透性功能紊乱,并最终造成细菌和真菌等微生物细胞的死亡。因此,CYP51酶在临床上常作为抗菌药物分子的主要靶标用来治疗微生物病原体引起的感染性疾病。近年来,随着国际诊疗水平的快速提高,创伤性外科手术的普遍展开、化疗导致的癌症病人免疫系统丧失以及其他的零免疫性相关疾病的发生,由各种条件致病菌引起的感染性疾病的发病率呈跳跃式上升状态,同时,各种合成类抗菌药物的大量使用导致微生物菌株的交叉耐药现象也日益严重。我们发现靶向抗菌药物可作用于真菌体内生物酶的活性位点,避开菌株耐药现象的同时又发挥抗菌活性,因此,需要我们将药物研发的重点放在靶向小分子抑制剂的研究上。通过查阅CYP51小分子抑制剂相关文献,本课题组发现1,2,4-三唑核心基团是一种优秀的化学结构母核,包括氟康唑、来曲唑、伏立康唑在内的临床上常用的典型CYP51靶点抗菌药物都具有1,2,4-三唑结构,可见1,2,4-三唑母核结构在CYP51小分子抑制剂的抑菌活性方面发挥了相当大的作用。本论文的主要研究内容包括:1.目标化合物6a-q的设计在CYP51小分子抑制剂的化学结构以及抑制剂与蛋白质复合物晶体结构的研究背景下,设计合成了4-(2-氯苯基)-5-(3,4-二氯苯基)-1,2,4-三唑-3-硫酮化合物(化合物6h),发现其具有良好的抗菌活性,并通过分子对接实验验证其与CYP51受体蛋白(PDB:6AY4)活性位点的结合亲和力。结果表明,母核4位氮原子与靶蛋白活性位点铁卟啉中心铁离子形成稳定螯合键,同时两个苯环侧链上的氯原子在结合过程中通过与氨基酸残基形成氢键而起着重要作用,抑制剂与靶蛋白的结合方式验证了化合物6h的优秀抗菌活性。在以上研究基础上,基于药效团拼接原理,本论文预计在1,2,4-三唑环的4-位引入卤代苯基的前提下,在5-位引入取代苯基、吡啶、烃基和三氟甲基苯基等药效基团,设计合成以1,2,4-三唑-3-硫酮为母核的系列衍生物。2.目标化合物6a-q的合成及结构确证本论文以取代苯甲酸和取代苯基异硫氰酸酯为原料,采用酯化、肼解、缩合、环化四步反应合成一系列1,2,4-三唑-3-硫酮化合物并对每步合成工艺进行条件优化,通过质谱(MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)、核磁共振碳谱(13C-NMR)确认合成17个结构正确的4-卤代苯基-5-取代基-3H-1,2,4-三唑-3-硫酮化合物。3.目标化合物6a-q的体外抗菌活性筛选本实验先采用琼脂扩散法初步测定17个目标化合物对白色念珠菌ATCC18804、申克孢子丝状真菌ATCC 32285、絮状表皮藓菌ATCC 52066的抗菌能力,结果显示所有化合物均有一定程度抗菌活性,采用微量稀释法进一步测定待测化合物的最小抑菌浓度(MIC值)。在测定结果中,化合物6h对三种菌株的MIC值分别为12.5,12.5,6.25μg/mL,表现出突出的抑菌活性,抑菌能力与对照药物酮康唑相当。化合物6a、6d、6m、6p对这三种菌株均表现出良好的抑制活性,化合物6e、6f、6g和6k对这三种菌株分别表现出一定程度的抗菌活性。根据抗菌活性测试结果对化合物构效关系初步分析可知,1,2,4-三唑环N-4位的邻位卤代苯基、5-位的取代苄基和间位卤代苯基、吡啶都能增强化合物的抑菌强度。