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1960年Jenning等首次明确提出缺血-再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）的概念，此后，该问题成为医学工作者在心肌梗死治疗领域面临的严峻挑战。为减轻心肌IRI并缩小梗死面积，尽全力挽救心肌细胞，人们在临床和实验研究中采取了多种干预措施。 内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是一种内源性细胞适应保护机制，适度的ERS能够激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)诱导细胞相关信号通路激活和应激蛋白表达增多，增强细胞对损伤的抵抗力和促进细胞生存;当应激原过强和应激持续时间过长时，内质网应激则倾向于诱导细胞凋亡。抑制miRNA-30c-2-3p表达能够通过升高XBP1降低内质网应激细胞的凋亡率。miRNA-30c-2-3p和XBP1是否参与心肌IRI和IPC心肌保护机制目前尚无研究。我们推测缺氧预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用在很大程度上是与调控内源性miRNA-30c-2-3p影响XBP1表达相关。 鉴于此，我们设计了这个离体细胞实验，研究的目的在于明确miRNA-30c-2-3p和XBP1在缺血预处理产生心肌保护作用的地位，以及评价抑制内源性miRNA-30c-2-3p表达调控XBP1对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。全部实验共分三个部分: 第一部分:体外培养新生大鼠心肌细胞和建立离体心肌细胞缺氧/复氧损伤模型、缺氧预处理模型 本部分的目的为确定成熟、稳定、纯度高和活性好的原代乳鼠心肌细胞体外培养方法，并采用厌氧培养法复合氮气构建离体心肌细胞缺氧/复氧损伤模型和缺氧预处理模型。 采用厌氧培养法复合氮气构建乳鼠离体心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。培养72h后的心肌细胞，随机分成7组:Sham组，即空白对照组，1h组，心肌细胞进行缺氧1h;1h/6h组，心肌细胞进行缺氧1h后复氧6h;3h组，6h组，各组处理后，采用乳酸脱氢酶(LDH)毒性检测试剂盒检测各组心肌细胞LDH漏出率，AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡情况。 采用厌氧培养法复合氮气构建乳鼠离体心肌细胞缺氧预处理模型。心肌细胞培养72h后，随机分成6组:Sham组，即空白对照组，心肌细胞正常培养无需任何处理;AR组，心肌细胞仅进行缺氧3h复氧6h;15min*1组，心肌细胞进行缺氧15min复氧15min再进行缺氧3h/复氧6h(简称AR);15min*2组，心肌细胞进行缺氧15min复氧15min两个循环后再进行AR;30min*1组，心肌细胞进行缺氧30min复氧30min后进行AR;30min*2组，心肌细胞进行缺氧30min复氧30min两个循环后再进行AR。处理后，采用乳酸脱氢酶(LDH)毒性检测试剂盒检测实验各组心肌细胞LDH漏出率，AnnexinⅤ/PI双染流式细胞凋亡术检测各组细胞凋亡情况。 结果显示:倒置相差显微镜下，可观察到原代心肌细胞活性好，搏动有力，在培养48～72h后形成功能合胞体，出现同步化搏动。cTnT-SABC-CY3(POD)免疫组化复合DAPI染色鉴定心肌细胞的纯度为(93.9±2.2)％。缺氧/复氧损伤模型构建中，与Sham组相比，1h组、1h/6h组、3h组、3h/6h组、6h组和6h/6h组LDH漏出率均明显增高，正常心肌细胞比例明显降低，凋亡细胞比例明显增高。与1h组相比，3h组和6h组LDH漏出率明显增高，正常细胞比例均明显降低，凋亡细胞比例明显增高。与3h组相比，3h/6h组和6h组LDH漏出率明显升高，正常心肌细胞比例明显下降，凋亡细胞比例明显升高。 缺氧预处理模型构建中，与Sham组相比，AR组、15min*1组、15min*2组、30min*1组和30min*2组LDH漏出率明显升高，正常心肌细胞比例明显下降，凋亡细胞比例明显升高。与30min*1组相比，AR组、15min*1组、15min*2组和30min*2组LDH漏出率明显增高，正常细胞比例显著下降，凋亡细胞明显增高。与AR组相比，15min*1组LDH漏出率，正常心肌细胞比例和凋亡细胞比例无显著统计学差异; 第二部分:XBP1和miRNA-30c-2-3p在心肌细胞缺氧预处理保护作用中的地位及miRNA-30c-2-3p对XBP1的靶向调控关系 本部分实验的目的是明确XBP1和miRNA-30c-2-3p在心肌缺氧预处理保护作用中的地位，并确定miRNA-30c-2-3p和XBP1是否具有靶向调控关系。 使用携带miRNA-30c-2-3p反义寡核苷酸或无义寡核苷酸的不同浓度的慢病毒对培养48h的原代心肌细胞进行感染，确定病毒感染心肌细胞的最佳浓度。慢病毒感染后心肌细胞进行缺氧/复氧损伤并用realtime PCR检测缺氧/复氧前、复氧1h、3h和6h时miRNA-30c-2-3p，XBP1和XBP1s蛋白的表达量。 构建构建野生型psiCHECKTM-2-XBP1-3UTR-wt和突变型psiCHECKTM-2-XBP1-3UTR-mut报告基因载体，将miRNA-30c-2-3p mimics或NC mimics和这些报告基因载体或空载体(psiCHECKTM-2)转染H9c2(2-1)大鼠胚胎心肌细胞。采用双荧光素酶基因报告试剂盒检测并分析各组荧光素酶活性。 结果显示:相比于缺氧/复氧前，AR组在复氧1h、3h和6h后XBP1和miRNA-30c-2-3p基因表达水平和XBP1s蛋白均明显增高，且在复氧3h时达到顶峰。相比于AR组，APC组在复氧1h、3h和6h时，XBP1和XBP1s表达水平均明显增高，miRNA-30c-2-3p表达发生明显降低，且APC组中，XBP1和XBP1s蛋白表达在复氧3h时达到峰值。 荧光显微镜下观察携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒感染后的心肌细胞，随感染浓度增加，GFP阳性细胞数逐级增多，MOI为50时，GFP细胞阳性率＞90％，与MOI为100时无统计学差异。选定病毒感染心肌细胞的最佳浓度为50MOI。感染携带miRNA-30c-2-3p inhibitor的慢病毒后，心肌细胞经缺氧/复氧损伤处理，相对于感染无义寡核苷酸序列的阴性对照组，AR前、复氧1h、3h和6h时，miRNA-30c-2-3p表达水平明显降低，而XBP1表达明显升高，XBP1s蛋白水平在复氧1h、3h和6h明显升高。 第三部分:miRNA-30c-2-3p调控XBP1对心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用及其机制的实验研究 本部分实验的目的是探讨内源性miRNA-30c-2-3p调控XBP1对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制。进一步明确miRNA-30c-2-3p和XBP1在心肌细胞缺氧预处理心肌保护作用中的相互关系。 将心肌细胞随机分成四组:空白对照组（Sham组），未经任何处理;缺氧/复氧损伤组（AR组），细胞经缺氧3h复氧6h处理;缺氧预处理组(APC组)，经缺氧30 min复氧30 min再缺氧3h复氧6h处理;慢病毒感染miRNA-30c-2-3p inhibitor组（INH组），细胞感染慢病毒miRNA-30c-2-3p inhibitor48 h后，进行缺氧3h复氧6h。除INH外，其余三组均在处理前48h感染携带无义寡核苷酸序列慢病毒。采用乳酸脱氢酶(LDH)毒性检测试剂盒检测实验各组心肌细胞LDH漏出率。 结果显示:与Sham组相比，AR组、APC组和INH组LDH漏出率均发生明显增高，正常心肌细胞比例明显下降，凋亡细胞比例明显升高。与AR组相比，APC组和INH组LDH漏出率明显降低，正常心肌细胞比例明显升高，凋亡细胞比例显著下降。与APC组相比，INH组心肌细胞LDH漏出率明显增多，正常细胞比例下降，凋亡细胞比例升高。 比较各实验组XBP1的表达，与Sham组相比，其余三组XBP1表达明显升高;与AR组相比，APC组和INH组XBP1表达明显升高;与APC组相比，INH组XBP1表达明显升高。观察各组XBP1s和BiP蛋白表达量，与Sham组相比，其余各组均发生明显增高;与AR组相比，APC和INH组XBP1s蛋白表达明显升高;与APC组相比，INH组XBP1s蛋白表达明显降低。 通过本实验，我们得出以下结论: 1.采用厌氧培养复合氮气的方法，通过缺氧3h/复氧6h能够成功构建新生大鼠离体心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。通过缺氧30min复氧30min再进行缺氧3h/复氧6h能够成功建立乳鼠离体心肌细胞缺氧预处理模型，且缺氧预处理可对缺氧/复氧损伤心肌细胞产生明显的保护作用，减少心肌细胞凋亡。 2.在心肌细胞内miRNA-30c-2-3p和XBP1具有靶向调控关系。低表达 miRNA-30c-2-3p进而增加XBP1表达是缺氧预处理产生心肌保护作用的重要内在机制之一。 3.通过抑制内源性miRNA-30c-2-3p可增加XBP1表达，对离体心肌细胞缺氧/复氧损伤产生明显的保护作用，降低细胞凋亡发生率。 4.BiP表达可受到miRNA-30c-2-3p对XBP1调控作用的影响，BiP可能是XBP1产生心肌保护效应的下游因子。