毕赤酵母己糖运载体同系物HXT1和HXT2的敲除及功能初步分析

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葡萄糖在酵母胞内的转运是依靠己糖运载体(hexose transporter)家族成员完成的。目前在酿酒酵母及其它酵母中已鉴定了20多个葡萄糖或结构类似葡萄糖的运载体编码基因(HXT)。各种己糖运载体的功能及表达受不同浓度葡萄糖调控。在作为优良蛋白表达系统的毕赤酵母中,目前国内外尚未有此类基因的相关报道。 本研究工作基于酵母同源重组率高的特性,利用双交换基因缺失法,选择G418和Zeocin作为筛选标记,在抗性基因的两端分别连上待缺失基因上下游各200 bp作为同源重组区,电转毕赤酵母GS115感受态,以kanamycin和shble抗性基因分别替换染色体上的己糖运载体编码基因HXT1和HXT2的部分或全部阅读框,成功构建了毕赤酵母GS115△HXT/和GS115△HXT2两株己糖运载体基因缺失菌株。 通过对缺失株进行相关表型分析发现:在生长和碳源利用方面,GS115△HXT1和GS115△HXT2的生长速率以及葡萄糖消耗速率较野生株相比有所下降;将酵母细胞由甲醇培养基转移至葡萄糖培养基诱导自噬,通过检测醇氧化酶AOX活性以及利用荧光显微镜观察过氧化物酶体,发现HXT1和HKT2基因与葡萄糖阻遏和过氧化物酶体自噬无关;荧光定量PCR考察HXT1和HXT2两个基因在不同浓度葡萄糖中的转录情况,推测HYT1可能是一个在较高浓度葡萄糖下发挥作用的运载体;而HXT2是一个在中低浓度葡萄糖水平发挥作用的运载体。另外还发现了果糖可以诱导HXT1基因缺失株AOX酶的表达。
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