论文部分内容阅读
目的肝癌是当下临床诊疗中的一种高发恶性肿瘤。LukS-PV是金黄色葡萄球菌分泌的一种毒素—杀白细胞素(Panton-Valetine leukocidin,PVL)中的S组分,课题组前期研究表明LukS-PV具有抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞的凋亡、周期阻滞的作用,但是其具体机制仍不清楚。本研究利用高通量组学测序技术探索LukS-PV抑制肝癌细胞增殖,诱导其凋亡、周期阻滞的具体分子机制,为其作为肝癌靶向抑制药物应用于临床奠定理论基础。方法(1)分别用PBS和0.5μmol/L LukS-PV刺激肝癌HepG2细胞24h后,提取蛋白。利用Western blot检测LukS-PV作用后乙酰化、琥珀酰化、巴豆酰化、2-羟基异丁酰化修饰水平的改变。(2)分别用PBS和0.5μmol/L LukS-PV刺激肝癌HepG2细胞24h后提取RNA和蛋白,送转录组学测序和定量蛋白组学测序。使用不同浓度的LukS-PV(0、0.25、0.5、0.75、1μmol/L)处理肝癌HepG2、Hep3B、Bel-7402细胞24h,分别使用qRT-PCR和Western blot检测HDAC2表达变化。(3)检测不同肝癌细胞和正常肝细胞HDAC2的表达量,使用HDAC2特异性Si RNA或HDAC2质粒转染肝癌细胞。(1)分别利用CCK-8和Ed U法检测肝癌细胞增殖能力的变化。(2)利用FCM检测肝癌细胞凋亡率和细胞周期的改变。(3)利用qRT-PCR和Western blot检测细胞凋亡相关蛋白和细胞周期调控蛋白表达量的改变。(4)使用不同浓度的LukS-PV(0、0.25、0.5、0.75、1μmol/L)处理肝癌HepG2、Hep3B、Bel-7402细胞24h,qRT-PCR检测PTEN m RNA表达水平的改变,使用Western blot检测PTEN、AKT、p-AKT蛋白表达水平的改变。使用HDAC2特异性Si RNA或者HDAC2质粒转染肝癌细胞后用Western blot检测PTEN、AKT、p-AKT蛋白表达水平的改变。使用qRT-PCR检测LukS-PV作用肝癌细胞后mi R-3691-5p表达水平的改变。使用HDAC2特异性Si RNA或者HDAC2质粒转染肝癌细胞后mi R-3691-5p表达水平的改变。(5)皮下注射肝癌细胞构建裸鼠肝癌模型,分为2组分别使用PBS和LukS-PV处理,监测两组肿瘤体积的大小。24天后处死裸鼠,取下肿瘤,比较两组肿瘤的体积大小和重量的差异。对肿瘤取样制片进行HE染色,免疫组化检测HDAC2和Ki-67表达。结果(1)LukS-PV作用于肝癌HepG2细胞后,整体乙酰化水平显著增高。(2)定量蛋白组学测序和转录组学测序结果显示LukS-PV作用于肝癌细胞后HDAC2表达下调,qRT-PCR和Western blot结果表明LukS-PV作用可以显著降低肝癌细胞株HDAC2的表达水平。(3)qRT-PCR和Western blot结果表明肝癌细胞株的HDAC2表达量高于正常肝细胞,且HepG2细胞中HDAC2表达量较高,Bel-7402细胞HDAC2表达量较低。HepG2细胞中敲低HDAC2后,细胞增殖能力下降,凋亡率增加,细胞周期阻滞在G1期,Bax、p21表达量增加,Bcl-2、Cyclin D1表达量降低。Bel-7402细胞中过表达HDAC2后,细胞增殖能力增加,凋亡率降低,细胞周期转换加快,Bax、p21表达量降低,Bcl-2、Cyclin D1表达量增加。过表达HDAC2可以抵抗LukS-PV的抑癌作用。(4)LukS-PV刺激肝癌细胞株后,qRT-PCR和Western blot结果表明PTEN表达量增加,Western blot结果显示p-AKT表达量降低而AKT无明显改变。敲低HDAC2后可以增加PTEN表达量,降低p-AKT表达量。过表达HDAC2降低PTEN表达量,增加p-AKT表达量,抵抗LukS-PV的作用。qRT-PCR结果表明LukS-PV刺激肝癌细胞株后,mi R-3691-5p表达下调。HepG2细胞中敲低HDAC2后,mi R-3691-5p表达下调。Bel-7402细胞中过表达HDAC2后,mi R-3691-5p表达上调,且可抵抗LukS-PV对mi R-3691-5p的抑制作用。(5)LukS-PV处理后,裸鼠皮下肿瘤的体积和重量均显著低于PBS组。HE染色显示,LukS-PV处理后裸鼠的肿瘤组织出现较大面积的坏死区域。免疫组化结果表明,LukS-PV组处理后裸鼠肿瘤组织中的HDAC2和Ki-67表达下调。结论(1)LukS-PV作用肝癌细胞后HDAC2的表达水平下调。(2)LukS-PV通过下调HDAC2抑制肝癌细胞增殖,诱导其凋亡和周期阻滞。(3)LukS-PV通过下调HDAC2促进PTEN表达上调,p-AKT表达下调。(4)LukS-PV能够在体内抑制肝癌的生长增殖。