本文对新型报告基因—绿色荧光蛋白基因在华癸中生根瘤菌-紫云英共生固氮体系早期结瘤阶段分子遗传学中的应用进行了探索性研究。主要研究结果如下： 1．考查了广宿主范围稳定性质粒pTR102应用于华癸中生根瘤菌分子生物学研究的可行性。采用发光酶发光活性和β-葡萄糖苷酶组织染色法比较研究了携带报告基因luxAB和gusA表达单元的pTR102标记质粒pHN106和pHN109在华癸中生根瘤菌7653R中的稳定性。结果表明：在自生与共生条件下，供试标记质粒在华癸中生根瘤菌中均能稳定存在，且稳定性达到100％。与标记紫云英根瘤的灵敏、稳定、可视的GUS组织染色法相比，未直接检测到luxAB标记根瘤的LuxAB发光活性。pTR102标记质粒的高度稳定性证明pTR102是适用于华癸中生根瘤菌分子遗传与生态学研究的广谱稳定载体。 2．将PCR扩增的1kb gfp cDNA片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-11C上，使gfp cDNA在带有lac操纵基因的T7噬菌体RNA聚合酶基因启动子的控制下、以自身的ATG作为翻译起始密码进行翻译。用获得的大肠杆菌表达质粒pHN115转化E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后的菌落发绿色荧光，并经SDS-PAGE检测到一条分子量约27KDa的蛋白带，表明wtgfp cDNA已在大肠杆菌中诱导表达。进一步去除启动子并保留S D序列构建成大肠杆菌启动子探针载体pHN117和G广宿主范围启动子探针载体pHN127。并经插入pBR322上665bp tetA／tetR双向启动子片段后得到的转化子均发绿色荧光验证，实现了wtgfp在大肠杆菌和华癸中生根瘤菌中的组成型表达。将7653R的总DNA经Sau3AI部分酶解并克隆到pHN127上，获得的融合子库，从中筛选到gfp组成型表达的具有调控活性的DNA片段。将重组质粒电转化7653R，获得的转化子发不同强度的绿色荧光。 3．进一步以红移且荧光强度提高21倍的gfpmut3为报告基因，构建了大肠杆菌启动子探针载体pHN1005，该载体上gfpmut3结构基因5’端的BamHI位点可用来克隆具有启动子活性的DNA片段并定量分析插入的启动子强度；其3’端含rRNA T1T2终止子，可允许克隆强启动子；在BamHI上游同样插入rRNA T1T2终止子以防止载体pUC19上的启动子的转录通读；gfpmut3结构基因上游还插入一段内含子序列使正反六种读码框的翻译均可被终止，可保证gfpmut3以正确的读码框翻译。BamHI两侧的SmaI、KpnI、SacI等位点可用于鉴定克隆的启动子片段。进一步构建了含gfpmut3探针单元的广宿主稳定启动子探针载体pHN1006，并采用鸟枪克隆技术从华癸中生根瘤菌7653R中钓取到一批gfpmut3组成型表达的启动子片段和一个gfpmut3受紫云英种子浸提物诱导表达的启动子片段，并进一步分析了GFP的存在对宿主根瘤菌生长、代谢及其与豆科植物共生结瘤的影响。利用激光共焦扫描显微镜和荧光显微镜原位监测了标记菌株2-33与紫云英早期共生结瘤阶段的侵入线与根瘤形成过程。为深入开展研究华癸中生根瘤菌的分子生物学研究积累了实验材料，也提出了应用gfp作为报告基因研究华癸中生根瘤菌基因表达调控的新方法。 4．将蓝色荧光蛋白基因bfp克隆到pET-11C上，转化BL21(DE3)后实现了bfp在大肠杆菌中的诱导表达。构建成含bfp的启动子探针载体pHN130与携带bfp表达单元的广宿主稳定华中农业大学博士学位论文史巧娟 标记质粒pHN133，实现了协在华癸中生根瘤菌中的组成型表达。为应用协心加双重报告 基因研究根瘤菌的分子生物学积累了材料。5.发现一个发较强绿色荧光的大肠杆菌突变株，提取质粒命名为pHN122。酶切鉴定、亚克 隆分析和序列测定结果证实pHN122上含有妙和另一个发生K79R突变的肺’。光谱测定 结果表明，GFP’的光谱特性虽与wtGFP相同，但发光强度提高了1.25一243倍。6，以华癸中生根瘤菌JSSA16( pHN109)和7653R(g万，mut3)进行竞争结瘤实验的结果与预期 相符，初步证明了g公助帅mut3双重报告基因在华癸中生根瘤菌占瘤率研究中的应用潜力。7.进行pHN122亚克隆分析过程中，发现衍生质粒pHN122EXB和pHN122ExG中妙和劝’ 组成型表达，并分析可能的原因是载体pIJ2925上某一区域具有组成型启动子活性而引起的 的，它们具有改造成筛选转录终止子克隆载体的潜力。