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目前器官移植是挽救终末期疾病患者的主要途径,但在移植后的两年内,约有35%的患者会发生急性排斥。肾移植(Kidney Transplant,KTx)领域,直到明显的移植伤害出现后,移植功能的衰退才能够被检测出来,具有一定的滞后性。血清肌酐可以评估肾小球滤过率,但是对于区分移植肾损伤和急慢性失功的敏感性特异性均不高。穿刺活检是移植排斥反应检测的金标准,属创伤性检查常伴有并发症。目前,移植患者面临的主要问题之一就是缺少用于早期诊断和连续监控移植物排斥风险的高灵敏度、高特异性且非侵入性的检测。游离DNA(Cell-free DNA,cfDNA)是指游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA,主要来自于细胞的凋亡或坏死。研究表明cfDNA可以作为最新的指示移植器官健康状态的生物标志物,具有无创、灵敏和实时等检测优势。本研究通过SNP(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)杂交捕获技术结合高通量二代测序技术对患者外周血中供体来源的cfDNA(Donor derived cfDNA,ddcfDNA)定量。结合临床穿刺活检结果研究肾移植患者ddcfDNA浓度与免疫排斥反应相关性,确定肾移植患者排斥的ddcfDNA浓度阈值。同时研究了肾移植术后早期ddcfDNA的动态变化,结果如下:(1)将无亲缘关系的人类血浆cfDNA样本以及具有直系亲缘关系的人类血浆cfDNA样本分别按比例混合稀释成:0.25%、0.5%、1%、2%、4%、8%、14%、24%、40%等9个浓度梯度上机测序。“非亲属”标准品样本的平均测序深度在120 X以上,有效SNP位点个数均在1790个以上,无亲缘关系标准品使用不依赖供体基因组信息和依赖供体基因信息对异源cfDNA检测结果一致,和理论值均显著相关(R2=0.998,R2=0.998)。“亲属”标准品样本的平均测序深度在140 X以上,有效SNP位点个数均在1000个以上,直系亲缘关系标准品使用不依赖供体基因组信息和依赖供体基因信息对异源cfDNA检测结果一致,和理论值均显著相关(R2=0.988,R2=0.998)。表明成功建立不依赖供体基因型的亲属移植和非亲属移植检测方法。(2)使用该方法检测了 54例肾移植术后患者体内ddcfDNA的浓度,结果显示临床排斥组(1.45%,n=37)的ddcfDNA浓度显著高于不排斥组患者的(0.53%,n=17)(p<0.01),ddcfDNA的阈值为1.25%。同时按照banff标准对患者排斥程度分级,结果表明细胞介导的排斥组(T-cell Mediated Rejection,TMR)(1.19%)及抗体介导的排斥组(Antibody Mediated Rejection,AMR)(2.48%)的ddcfDNA浓度均显著高于非排斥组(0.53%)(p=0.037,p=0.007),TMR与AMR组间无显著性差异(p=0.71)。此外,IA排斥组ddcfDNA的浓度(0.92%)与IB排斥组的ddcfDNA的浓度(5.3%)差异不显著(p=0.99)。(3)研究了肾移植术后早期ddcfDNA的动态变化,监测了 21位肾移植患者术后第1天至7天的ddcfDNA的动态变化。结果表明术后早期ddcfDNA浓度呈L型下降,血管开放3小时ddcfDNA浓度的中位数为20.69%,术后第一天下降至5.22%,术后第二天维持稳定水平。术后第一天,心脏死亡移植(Donation of Cardiac Death,DCD)组ddcfDNA浓度(44.99%)显著高于亲属移植(Living Donor Recipient Transplant,LDRT)组的 ddcfDNA浓度(10.24%)(p<0.01)。延迟复功(Delayed Graft Function,DGF)组的ddcfDNA的浓度与non-DGF组无显著差异。此外,组织活检患者血浆ddcfDNA的动态变化表明ddcfDNA浓度先下降后上升(浓度超过1%)与排斥有关。若患者体内ddcfDNA浓度较高(超过1%)但仍在逐渐下降,表明与排斥无关,仍可维持治疗,等待肾功能恢复。综上所述使用cfDNA作为指示移植器官健康的标志物具有巨大的潜力。使用该方法能够更好的辅助临床医生监测患者的健康状况,有利于肾移植患者的长期生存。