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明胶来源广泛,成本低。以罗非鱼鳞明胶为蛋白质原料,酶解制备生物活性肽,不仅可以实现水产加工废弃物的高值化利用,而且可以缓解由于水产品加工废弃物排放而带来的环境污染问题。本课题首先对原料蛋白进行分析,根据血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽和抗氧化肽的构效关系研究成果,选取特异性蛋白酶Alcalase水解鱼鳞明胶,并测定水解产物的ACE抑制活性和超氧阴离子清除活性。通过超滤处理富集具有较高活性的ACE抑制肽和超氧阴离子清除肽。对高活性超滤组分进行氨基酸组成和分子量分布研究,同时通过体外模拟消化道环境探讨活性肽对胃肠道消化酶的抗性。主要研究成果如下:选用鱼鳞明胶作为蛋白质原料,其蛋白质含量高达90.15 %。对原料蛋白质进行氨基酸组成分析,结果表明明胶中必需氨基酸含量在总氨基酸中所占比例达到27.10%,含有较多的疏水性氨基酸(39.43%)和抗氧化氨基酸(48.83%),对ACE抑制活性和自由基清除活性都有贡献的脯氨酸和羟脯氨酸含量高,适合用作制备生物活性肽的蛋白质原料。选用特异性蛋白酶Alcalase,以水解度为指标,在单因素实验的基础上,通过响应曲面优化得到该酶的最佳作用条件:温度54.5℃,pH值7.7,底物浓度1.8%(W/V),加酶量1.0%(W/W)。水解度与生物活性的关系研究结果表明,未水解的鱼鳞明胶基本不具有生物活性;经过Alcalase水解后,不同水解度的水解物对超氧阴离子显示出不同程度的清除活性,对ACE显示出不同的抑制活性,酶解鱼鳞明胶制备生物活性肽存在一个最佳的水解时间点或水解度。在Alcalase最佳作用条件下,水解鱼鳞明胶4h所得水解物的超氧阴离子清除活性最高,其IC50为0.36mg/mL,水解度为14.11%;水解明胶6h所得水解物的ACE抑制活性最高,其IC50为0.56mg/mL,水解度为15.54%。在传统紫外分光光度法方法的基础上,经过改良设计,建立了一种体外测定ACE抑制活性的反相高效液相色谱法。该方法反应试剂用量小,使用甲醇-水体系(60∶40,含0.1%TFA)作为流动相,分析时间短,分离效果好,且不需从反应体系中提取马尿酸,可用于大批量筛选ACE抑制肽。通过截留分子量为10000Da、5000Da的膜超滤处理后,水解物的超氧阴离子清除和ACE抑制活性都有所提高。随着截留分子量的减小,超滤物的生物活性逐渐升高,分子量小于5000Da的超滤物活性最高。这说明超滤技术是富集超氧阴离子清除肽和ACE抑制肽的有效手段。对超氧阴离子清除活性最高的水解物超滤组分进行分子量分布和氨基酸组成分析,结果表明,水解物中分子量小于5000Da的肽含量在80%以上,多肽中抗氧化性氨基酸保存率高。同样对ACE抑制活性最高的水解物超滤组分进行分子量分布和氨基酸组成分析,结果表明,水解物中分子量小于5000Da的肽含量在90%以上,多肽中对ACE抑制活性贡献大的脯氨酸、羟脯氨酸、色氨酸等氨基酸的保存率高,此鱼鳞明胶水解物的ACE抑制活性主要是来源于C末端含脯氨酸、羟脯氨酸和色氨酸的寡肽。通过模拟体内消化道环境研究了胃肠道消化酶处理对水解物超滤组分的超氧阴离子清除活性和ACE抑制活性的影响。高活性超滤组分经过胃蛋白酶和胰蛋白酶的模拟消化处理后活性变化不显著,说明此多肽对胃肠道的消化酶具有较强的抗性。