论文部分内容阅读
植物中的蓝光受体主要有7个，分别为两个隐花色素（CRY1和CRY2），两个向光素（phot1和phot2）和三个LOV/F-Box/Kelch-domain蛋白（ZTL，FKF和LKP2）。隐花色素（Cryptochromes，CRY）是类似光裂解酶的黄素蛋白，由N端的PHR（Photolyase Homohogous Region）结构域和C端的CCE（CryptochromeC-Terminal Extension）结构域构成。PHR结构域由光裂解酶进化而来，序列高度保守，隐花色素的PHR结构域以非共价闭合的方式结合生色团（favin adeninedinucleotide，FAD），感受蓝光信号。CCE结构域是隐花色素特有的结构域，是隐花色素的功能效应区，无特定结构。目前，对于拟南芥隐花色素蛋白CRY1和CRY2介导的蓝光信号转导途径已有一定的了解，但CRY的原初光反应（photoexcitation）及其去敏化反应（desensitization）两个重要过程的分子机制至今尚不清楚。已有证据暗示，拟南芥CRY的磷酸化及二聚化对其起始蓝光信号转导至关重要，但各原初反应之间的相互关系尚不清楚，例如CRY的二聚化为其功能所必需的，然而已报道的CRY的二聚化反应均无蓝光反应，有研究推测这是由于植物体内相关蛋白介导的去敏反应而造成的。因此，发现与隐花色素的二聚化及去敏化反应相关的蛋白并探究其功能，对揭示植物蓝光信号转导的起始机制具有非常重要的意义。本研究在本实验室及合作者通过FOX huntingsysterm筛选得到的可能与CRY2互作的蛋白BICs（blue-light-dependent inhibitorof cryptochromes）的基础上，通过酵母双杂交等实验，证明了CRY2与BIC之间的互作机制，并通过优化拟南芥叶肉细胞原生质体的提取、转化体系，发现了植物体内存在蓝光依赖的CRY2二聚化机制，证明了BICs能够抑制CRY2蓝光特异的二聚化，影响CRY2光小体的形成及CRY2与其互作蛋白CIB1的互作，从而影响CRY2介导的蓝光信号转导。本论文的具体研究结果如下：（1）通过酵母双杂交实验和植物体内免疫共沉淀实验，分别在体外和体内证明了BIC1、BIC2蛋白能够与蓝光受体CRY2相互作用。其中，BIC1与CRY2是组成型的相互作用，BIC2与CRY2是蓝光依赖的相互作用。（2）优化了拟南芥原生质体的提取和转化体系，利用双分子荧光互补技术（BiFC）在拟南芥叶肉细胞原生质体中证明了蓝光受体CRY2在植物体内同源二聚体的形成是蓝光依赖的，同时证明了BIC1、BIC2蛋白能够抑制CRY2蓝光依赖的同源二聚体的形成。（3）创新性地利用拟南芥叶肉细胞原生质体研究CRY2光小体的形成和变化趋势，证明了BIC1、BIC2蛋白能够抑制CRY2蓝光依赖的光小体的形成，从新的角度，证明了BIC1、BIC2蛋白对CRY2介导的蓝光信号转导途径的抑制作用。（4）利用双分子荧光互补技术（BiFC）在拟南芥叶肉细胞原生质体中证明了BIC1、BIC2蛋白能够抑制CRY2与其互作蛋白CIB1的相互作用，从而影响CRY2的信号转导。