浸矿环境是酸性和高浓度重金属存在的极端环境,浸矿细菌的优劣取决于其氧化能力和抗逆性能,其氧化机制和抗逆机制是研究的重点。嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,简称A. caldus)是一种专性化能自养硫氧化细菌,以卡尔文循环固定空气中的CO2作为碳源,能氧化无机还原性硫化物获得生长所必需的能量和还原力,A. caldus在生物冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等方面发挥重要作用,是硫氧化浸矿菌,其单质硫的活化氧化机制是有待解决的重要问题。有研究认为,单质硫活化氧化依赖于还原型谷胱甘肽GSH。谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR)能催化氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽两者问的相互转化,是产生GSH的关键酶,研究该酶的功能对硫活化氧化机制的阐释有重要意义。GR还能清除生物体内的活性氧,在对抗重金属、高盐和氧化剂等逆境方面发挥重要作用。因此,本文将对A. caldus的GR在硫氧化和抗逆方面的功能进行下列研究,对提高其工业应用前景具有重要意义。第一,对A. caldus MTH-04中的gr(or0872)进行生物信息学分析,结果表明gr的序列高度保守,可能位于细胞质中。然后克隆gr并在E.coli中进行表达,对其酶活及酶学性质进行测定,研究结果表明：GR的酶活为415.8U/mgprotein,最适pH为7.0,最适温度30℃,Cu22_、Zn2+、Cd2+、Ag+、Fe2+、Co2+均强烈抑制酶活,而Ca2+、Mg2+、Sn2+、Mn2+对酶活影响不大。第二,利用基于细菌自身Ree重组系统的”in-out"敲除策略,构建gr的无痕敲除株△gr和相应的回补株Agr(pJRD215-gr),并将gr在A.caldus MTH-04中过表达获得含有tac强启动子的过表达菌株A.c(pJRD215-tac-gr)。第三,通过对Agr(pJRD215-gr)、A.c (pJRD215-tac-gr)及A. c(wild)在S0培养条件下的生长曲线测定以及各菌株在Zn2+金属离子刺激和盐刺激条件下生长曲线的测定等表型分析,结果表明在以S0为能源时,各菌株生长无明显差异,但在有Cu2+、Zn2+、Na2SO4刺激时,随着刺激浓度的升高,菌株表现出明显的延迟生长,且对△gr的抑制作用尤为明显,甚至致死,而回补株△gr(pJRD215-gr)的谷胱甘肽还原酶功能恢复,其生长情况恢复到与野生型基本致,这些结果都表明gr在抗逆过程中发挥重要的作用。第四,通过荧光定量RT-PCR分析,比较缺失突变株△gr、回补株、过表达菌株及野生株在S0培养以及金属离子刺激下的硫氧化系统相关基因、谷胱甘肽代谢相关基因和氧化压力应答相关基因在表达水平的差异,发现：①以单质硫为能源时,gr敲除株中谷胱甘肽还原酶基因不表达,但是谷胱甘肽合成酶以及参与生成GSH的硫加双氧酶等基因上调表达；在过表达菌株中,gr上调表达,此时,谷胱甘肽合成酶以及受谷胱甘肽合成酶调节的谷胱甘肽-硫-转移酶均下调表达,通过这些基因的协同作用,生物体内的[GSSG]/[GSH]水平仍能维持在正常水平,因而对菌株的生长无明显影响。②以单质硫为能源,存在Cu2+、Zn2+刺激时,gr敲除株中glutathione reductase不表达,此时thiol peroxidase,peroxiredoxin, thioredoxin reductase,glutathione peroxidase等抗氧化酶均上调表达；而在gr过表达菌株中,glutathione reductase上调表达,此时其他抗氧化酶恢复正常表达水平。这些结果表明,当谷胱甘肽还原酶正常表达时,谷胱甘肽还原酶在清除由重金属造成的ROS过程中发挥重要作用,当谷胱甘肽还原酶缺失时,相关的抗氧化酶上调表达,清除生物体内的毒性物质。