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目前，缺血性脑卒中已成为全球人口死亡及致残的重要疾病。脑缺血后，由于组织血供不足，神经细胞代谢障碍，最终导致细胞不可逆性损伤和死亡的一系列病理生理学过程和机制的了解已比较清楚，但目前临床上对脑卒中的治疗尚缺乏有效的治疗措施。脑缺血/低氧预适应(I/HPC)引起的神经保护机制为脑卒中的治疗提供了新的思路。I/HPC即预先给予机体或器官亚致死性的缺血/低氧刺激，可明显提高组织对缺血/低氧性损伤的耐受能力。随后的研究发现，间歇、短暂地阻断颈动脉血流也可明显减轻后续脑缺血导致的豚鼠海马CA1区神经元的死亡，并由此引发了人们对脑I/HPC研究的兴趣。目前关于脑I/HPC形成的可能机制包括腺苷及其受体、ATP-敏感钾通道、一氧化氮合成酶、低氧诱导因子、热休克蛋白(HSP)70、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体、超氧化物歧化酶(SOD)和缝隙连接蛋白43等。然而，这些细胞信号分子机制并不能完全解释脑Ⅰ/HPC的保护效应。值得注意的是，无论上述那种信号转导机制均涉及蛋白激酶C(PKC)的激活，提示PKC介导的信号通路是多种因素作用的共同通路。本课题组以前的研究发现，经典型PKC(cPKC)βⅡ、γ和新奇型PKC(nPKC)ε及其相互作用蛋白参与了HPC诱导的脑神经保护作用。最近，本课题组又通过miRNAs基因芯片技术，在HPC和脑中动脉阻塞(MCAO)致缺血性脑卒中小鼠脑皮层筛选出19个差异表达miRNAs，并通过生物信息学预测出差异miRNAs-cPKCβⅡ、γ和nPKCε相互作用蛋白可能的调控网络。miRNAs作为一类非编码蛋白质、长度为21-23个核苷酸的微小RNA分子，主要通过转录后水平调节特定基因的蛋白表达，近年引起了很大的关注。在本研究中，我们通过生物学方法进一步验证了差异miR-181b是否通过调节cPKCβⅡ、γ和nPKCε相互作用蛋白在脑缺血性损伤中发挥作用，为寻找参与HPC脑神经保护作用的可能信号分子提供实验依据。 在细胞水平上，离体培养小鼠成神经瘤N2A细胞，采用3h氧-糖剥夺(OGD)/24h复糖复氧模拟缺血/再灌细胞模型。细胞分组如下:空载体对照组(Vehicle)、转染miR-181b前体组(Pre-miR-181b)、前体对照组(Pre-miR Ctrl)、转染miR-181b抑制剂组(Anti-miR-181b)、抑制剂对照组(Anti-miR Ctrl)。首先用Pre-miR-181b、Anti-miR-181b、Pre-miR Ctrl、Anti-miR Ctrl和Vehicle转染N2A细胞48h后，再进行3h OGD/24h复糖复氧刺激。应用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和乳酸脱氢酶(LDH)法评价miR-181b对OGD致N2A细胞缺血损伤的影响;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)检测miR-181b对OGD致N2A细胞凋亡的影响;蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测过表达或抑制miR-181b对其靶基因HSPA5、UCHL1和ACO2(PKC亚型特异性相互作用蛋白)的调节。最后通过双荧光素酶报告基因验证miR-181b对其靶基因的直接调节作用。 在整体动物水平上，选用成年雄性BALB/c小鼠(12-14w,18-22g)，实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIH Publication No.80-23)进行。实验动物分组如下:假手术对照组(Sham)、大脑中动脉阻塞(MCAO)组、侧脑室注射miR-181b拮抗剂后大脑中动脉阻塞(MCAO+miR-181b antagmoir)组和侧脑室注射miR-181b对照(MCAO+ miR-181b Ctrl)组。应用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测缺血小鼠脑组织miR-181b拮抗剂对其靶基因HAPA5和UCHL1蛋白表达和激活Caspase-3水平影响;实时定量RT-PCR观察侧脑室给予miR-181b拮抗剂及对照后miR-181b的表达情况;神经行为学评分、Nissl染色等方法评价miR-181b拮抗剂对小鼠脑缺血损伤程度的影响。实验数据使用单一因素方差分析(One way ANOVA)和Bonferroni检验进行统计学处理，以均数±标准误(X±SEM)表示，其中p＜0.05为差异显著。实验结果如下: 1.缺血性脑卒中和OGD对microRNA-181b表达的影响 实时定量RT-PCR检测结果表明，20min MCAO后再灌24h小鼠脑组织及3hOGD/24h复糖复氧刺激N2A细胞内，miR-181b的表达水平明显降低(p＜0.05，每组n=6)。然而，miR-30a的表达水平在20min MCAO后再灌24h小鼠脑组织内表达明显增高(p＜0.05，每组n=6)。这一结果与本实验室通过基因芯片在HPC和MCAO小鼠脑皮层组织鉴定出的miR-181b、miR-30a的表达变化一致。 2.microRNA-181b对OGD致N2A细胞缺血性损伤的影响 为了探讨miR-181b在OGD致N2A细胞损伤中的作用，首先用Pre-miR-181b、Anti-miR-181b、Pre-miR Ctrl、Anti-miR Ctrl和Vehicle转染N2A细胞48h后，实时定量RT-PCR结果显示Pre-miR-181b及Anti-miR-181b可分别使N2A细胞内miR-181b mRNA水平显著的增加和减少(p＜0.05，每组n=6);而Pre-miR Ctrl、Anti-miR Ctrl和Vehicle对miR-181b表达没有影响。3h OGD/24h复糖复氧刺激N2A细胞后，MTT结果显示，Pre-miR-181b(过表达miR-181b)可明显增加OGD对N2A细胞的损伤作用(p＜0.05，每组n=10)，而Anti-miR-181b（降低miR-181b的表达）可使OGD处理的N2A细胞活力显著增加(p＜0.05，每组n=10);同样LDH结果显示，Pre-miR-181b可显著加重OGD致N2A细胞的损伤(p＜0.05，每组n=10)，Anti-miR-181b可使OGD处理的N2A细胞损伤减轻。在Non-OGD的情况下， MTT和LDH结果都显示miR-181b表达水平的变化对N2A细胞活力没有明显影响。进一步通过TUNEL方法检测发现，Pre-miR-181b致OGD引起的N2A细胞凋亡明显增加(p＜0.05，每组n=5)，而Anti-miR-181b可以缓解OGD引起的N2A细胞凋亡(p＜0.05，每组n=5)。 3.microRNA-181b可直接调节靶基因HSPA5和UCHL1的蛋白表达 通过生物信息学分析预测miR-181b可能调节的cPKCβⅡ，γ和nPKCs相互作用蛋白分别是热休克蛋白A5(HSPA5)、泛素羧基末端酯酶L1(UCHL1)和线粒体顺乌头酸酶(ACO2)。蛋白印迹(Western blot)检测结果表明，转染 Pre-miR-181b过表达miR-181b时，HSPA5和UCHL1蛋白表达量显著降低(p＜0.05，每组n=6);而转染Anti-miR-181抑制miR-181b表达后，HSPA5和UCHL1蛋白表达水平明显增加(p＜0.05，每组n=6)。同时，实时定量RT-PCR检测结果显示，过表达或抑制miR-181b后，HSPA5及UCHL1 mRNA表达水平均无明显变化。而过表达或抑制miR-181b后，ACO2的蛋白水平没有明显的变化。为进一步验证miR-181b对HSPA5和UCHL1是否为直接调节作用，首先将HSPA5和UCHL1 mRNA的3-UTR序列插入到荧光素酶报告基因检测系统中。再将构建好的质粒分别与Pre-miR-181b和Anti-miR-181b共转染N2A细胞，然后进行荧光强度检测。荧光素酶报告基因检测结果显示，Pre-miR-181b显著抑制荧光素酶活性(p＜0.05，每组n=5)，而转染Anti-miR-181b则荧光强度明显升高(p＜0.05，每组n=5)。结果表明miR-181b可直接与HSPA5和UCHL1 mRNA的3-UTR结合，从而负性调控HSPA5和UCHL1的蛋白表达水平。 4.下调microRNA-181b可缓解MCAO缺血性脑卒中小鼠脑缺血性损伤 为了评价miR-181b在MCAO缺血性脑卒中小鼠脑缺血性损伤中作用。首先提前48h通过微量注射泵对小鼠侧脑室持续给予miR-181b拮抗剂Anti-miR-181b，48h后行MCAO20 min/再灌24h;实时定量RT-PCR结果显示损伤侧脑组织内miR-181b表达水平明显降低(p＜0.05，每组n=3)。蛋白免疫印迹(Western blot)结果提示，侧脑室给予miR-181b拮抗剂，使HSPA5和UCHL1蛋白表达水平明显增加(p＜0.05，每组n=3);同时，激活的Caspase-3明显减少(p＜0.05，每组n=3)。 应用神经行为学评分，Nissl染色等检测miR-181b拮抗剂Anti-miR-181b对MCAO缺血性脑卒中缺血小鼠神经行为和脑组织损伤程度的影响。结果表明，MCAO20min后再灌24h，小鼠的神经行为学受到严重损伤，而miR-181b拮抗剂可明显缓解缺血性脑卒中脑缺血小鼠的神经行为评分(p＜0.05，每组n=6);另外，Nissl染色结果显示，miR-181b拮抗剂能明显降低缺血性脑卒中小鼠脑内神经元丢失(p＜0.05，每组n=3)。 综上所述，本研究首次证实了miR-181b通过负性调节cPKCβⅡ，γ和nPKC￡相互作用蛋白HSPA5和UCHL1的表达，在缺血性脑卒中小鼠脑缺血性损伤中发挥重要作用，所获实验成果从miRNAs角度，进一步丰富了人们对脑缺血/低氧损伤和适应细胞信号转导机制的认识，并为临床上开发抗缺血/低氧性脑损伤药物提供了实验依据，具有潜在的实用价值。