论文部分内容阅读
目的研究脂肪基质细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSC)源性神经元是否具有正常神经元的突触内吞功能。方法1应用针吸法获取成人皮下脂肪组织,提取ADSC培养及传代。2选取第三代ADSC,采用β巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)诱导分化为神经元,将细胞分为ADSC组、1h、3h、5h、8h组。3扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)下观察分化各组细胞的三维形态学特征。4 ADSC源性神经元特异性标志物检测:免疫细胞化学法及Western-blotting法检测各组细胞神经元的特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE)及微管相关蛋-2(Microtubule associated protein 2,MAP-2)的表达情况。5 ADSC源性神经元突触内吞功能核心标志物检测:免疫细胞化学法、免疫荧光双标法以及Western-blotting法定性、定位和定量检测各组细胞中神经元内吞作用核心蛋白衔接蛋白-2(AP-2)、网格蛋白(Clathrin)、吞蛋白(Endophilin)、动力蛋白(Dynamin)、热休克同源蛋白(Hsc70)的表达情况。6透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)下观察各组分化细胞的超微结构特征。7 ADSC源性神经元突触的内吞功能实验:应用FM1-43神经元突触内吞功能实验和硒化镉量子点(Cadmium selenide quantum dots,Cd Se QDs)神经元突触内吞功能实验检测分化细胞是否具有内吞功能。8统计学分析方法:本实验所获得的实验数据经Excel 2007建立数据库,采用SPSS 17.0软件包进行数据统计分析,数据以sx±表示,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间比较,LSD检验、Tamhane’s T2检验进行两两比较,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1 ADSC提取及培养后24h内贴壁,可呈圆形、多角形、不规则形。随着培养时间延长,ADSC逐渐变为长梭形且呈旋涡状聚集。传代至第三代完全纯化的ADSC主要呈现规则的长梭形密集生长且呈绵羊卷样分布趋势。2扫描电子显微镜下观察ADSC组细胞呈梭形生长,诱导分化1h时细胞两端梭形部位变细边长,诱导分化3h时细胞伸出一根较长且末端略膨大的突起,同时可见多根较短突起且两侧伸出类树枝样细小分支,诱导分化5h时细胞突起分支延伸数量增多,其中伸出一根较细长的突起,较长突起末端膨大并且伸出大量微绒毛,诱导分化8h时细胞突起分支减少、断裂,细胞形态退化。3 ADSC源性神经元特异性标志物检测结果:ADSC组未见NSE和MAP-2阳性表达细胞,在诱导分化各组均可见NSE及MAP-2阳性表达细胞。本实验中各组细胞NSE和MAP-2表达水平均于诱导分化5h时达高峰(P均<0.05)。4 ADSC源性神经元突触内吞功能核心标志物检测结果:ADSC组未见AP-2、Clathrin、Endophilin、Dynamin及Hsc70的阳性表达细胞,在诱导分化各组细胞均可见AP-2、Clathrin、Endophilin、Dynamin及Hsc70的阳性表达细胞。随着诱导分化时间延长,AP-2、Clathrin、Dynamin及Hsc70的阳性表达水平均于5h时达高峰(P均<0.05),Endophilin的阳性表达水平于5h时达高峰,8h时Endophilin阳性表达水平下降但与5h组比较差异无统计学意义(P>0.05)。5透射电子显微镜下观察ADSC组细胞胞质丰富,核饱满,内含少量细胞器,诱导分化1h时细胞逐渐形成短小突起,胞质出现少量溶酶体等细胞器,诱导分化3h时细胞短小突起延长,末端可见较多数量囊泡,可见含有大量线粒体及囊泡的类突触前膜结构及电子致密度较高的类突触后膜结构,诱导分化5h时可见细胞表面大量突起及微绒毛,突起处可见大量形态各异的囊泡结构,胞质内细胞器含量丰富并且富含尼氏体这种神经元的特异性细胞器结构,诱导分化8h时细胞突起及微绒毛数量减少,细胞器肿胀,并且含大量次级溶酶体。6 ADSC源性神经元突触的内吞功能实验结果:FM1-43神经元突触内吞功能实验结果显示ADSC组FM1-43阳性表达细胞外溶液及细胞膜,诱导分化各组细胞可见突起处囊泡呈周围FM1-43阳性表达且中间阴性表达的环状类圆形膜样结构,FM1-43阳性表达强度于诱导5h时达到高峰,Cd Se QDs神经元突触内吞功能实验结果显示ADSC组Cd Se QDs于细胞质中呈云片状阳性表达,诱导分化各组细胞突起处可见呈Cd Se QDs阳性表达颗粒样结构,Cd Se QDs阳性表达强度于诱导5h时达到高峰。结论ADSC源性神经元具有正常神经元的生理特征,并且具有位于突起末端的囊泡样超微结构特征以及神经元突触内吞功能所需核心蛋白因子AP-2、Clathrin、Endophilin、Dynamin、Hsc70的表达,FM1-43及QDs神经元功能实验检测验证了ADSC源性神经元具有典型的神经元突触内吞功能。图18幅;表12个;参89篇。