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缺血再灌注损伤是缺血缺氧器官在恢复血供和氧供后损伤反而加重的病理生理过程。临床上肝移植、严重肝外伤及肝叶切除的外科实践中,往往需要暂时或较长时间阻断入肝血流,当恢复入肝血流后往往不可避免地发生肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI)。HIRI常引起移植术后肝功能受损、胆道损害等多种并发症,显著影响肝移植预后。因此如何减轻移植肝脏的缺血再灌注损伤是肝脏外科领域中的热点及难点问题之一。血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)又称为热休克蛋白32,可将血红素分解成CO、胆绿素和游离铁,是催化血红素降解的起始酶和限速酶。HO-1及其降解产物组成了机体重要的内源性保护系统,参与多种病理生理过程,发挥抗氧化、抗炎、调节细胞周期及调节微循环等作用,是重要的自由基清除剂及抗缺血再灌注损伤因子,故也被称为“移植物存活基因”。TOLL样受体家族(Toll-like receptors, TLRs)是一种模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别保守性病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),属于IL-1R家族,是连接先天免疫反应与适应性免疫反应的关键蛋白。相关研究推测TLR4可能是HO-1在肝缺血再灌注损伤中一种潜在性阻碍物。但HO-1与TLR4在肝缺血再灌注损伤中作用的具体机制尚不完全明确。[目的]通过建立大鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型,应用HO-1的特异性诱导剂钻原卟啉和抑制剂锌原卟啉对实验动物进行预处理,观察HO-1对肝缺血再灌注损伤的影响,及HO-1的表达对TLR4信号通路中相关因子的影响并探讨其可能的作用机制,为临床肝移植缺血再灌注损伤的防治提供一种新的研究思路。[方法]1、参照Nauta RJ等的方法操作,建立大鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型。2、SPF级健康成年雄性SD大鼠,体重220-250g,随机分为四组：(1)假手术组(S组)(n=9)：术前不给予注射试剂,仅行开腹及解剖肝门手术；(2)缺血再灌注组(Ⅰ组)(n=9)：术前不给予注射试剂,行肝脏缺血再灌注；(3)钴原卟啉(CoPP)组(C组)(n=9)：行肝脏缺血再灌注术前24小时腹腔注射HO-1诱导剂CoPP;(4)锌原卟啉(ZnPP)组(Z组)(n=9)：行肝脏缺血再灌注术前24小时腹腔注射HO-1抑制剂ZnPP。术后24h处死大鼠,抽取腹主动脉血5m1并获取新鲜缺血肝脏组织,检测血清ALT和AST评价肝功能。ELISA法检测血清HMGB1含量。RT-PCR检测肝脏组织(TNF-α、IL-6、 HO-1、IL-10) mRNA的表达水平；Western blotting检测肝组织蛋白(TLR4、 MyD88、p/t-IRF3、TRIF),核蛋白(NF-κB)和胞浆蛋白IκB-α的相对表达量。免疫组化法观察巨噬细胞CD11b+对肝汇管区的浸润。病理切片观察肝脏形态学改变,评价肝组织损伤情况。[结果]1、参照Nauta RJ等的方法成功制备了大鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型36例,肝脏局部缺血时间为60min。2、调节HO-1的表达对肝脏的影响：①HO-1表达的影响。与S组相比,Ⅰ组、C组、Z组HO-1表达升高(P<0.05)；与Ⅰ组相比,C组HO-1表达明显升高(P<0.05),Z组HO-1表达明显降低(P<0.05)。②肝功能的影响。与S组相比,Ⅰ组、C组、Z组转氨酶(ALT、AST)明显升高(P<0.05)；与Ⅰ组相比,C组转氨酶(ALT、AST)明显降低(P<0.05),Z组转氨酶(ALT、 AST)明显升高(P<0.05)。③肝形态学的改变。S组肝细胞正常,无变性或坏死,肝窦结构清晰,仅见少许炎症细胞浸润。Ⅰ组肝细胞广泛水肿,不同程度空泡样变性,部分肝细胞呈灶状坏死,核溶解,嗜酸性增加,炎症细胞浸润增加。与Ⅰ组相比,C组的肝细胞损伤较轻,肝小叶结构基本正常,肝细胞及汇管区基本正常,仅少数肝细胞轻度水肿,炎症细胞浸润减少。与Ⅰ组相比,Z组肝细胞损伤更为严重,肝细胞广泛水肿,大片状肝细胞坏死、核溶解,门静脉周围大量炎症细胞浸润。3、调节HO-1的表达对TLR4信号通路的影响：与S组相比,Ⅰ组、C组、Z组HO-1表达升高(P<0.05),血清HMGB-1含量升高(P<0.05),肝组织蛋白(TLR4、p-IRF3、TRIF、t-IRF3、MyD88)表达均增加(P<0.05),核蛋白NF-κB水平均升高(除C组稍降低),胞浆蛋白IκB-α水平均升高(P<0.05),炎症因子(TNF-α、IL-6)表达明显上调(P<0.05),肝汇管区巨噬细胞CD11b+聚集明显增多,肝组织损伤加重；与Ⅰ组相比,C组HO-1表达明显升高(P<0.05),血清HMGB-1含量降低(P<0.05),肝组织蛋白(TLR4、p-IRF3、 TRIF、t-IRF3、MyD88)及核蛋白(NF-κB)的水平均有降低(P<0.05),胞浆蛋白IκB-α水平升高(P<0.05),炎症因子(TNF-α、IL-6)表达明显减少(P<0.05),肝汇管区巨噬细胞CDl1b+聚集明显减少,肝组织损伤明显减轻；与Ⅰ组相比,Z组HO-1表达明显减少(P<0.05),血清HMGB-1含量明显增加(P<0.05),肝组织蛋白(TLR4、p-IRF3、TRIF、t-IRF3、MyD88)及核蛋白(NF-κB)的水平明显升高(P<0.05),胞浆蛋白IκB-α水平降低(P<0.05),炎症因子(TNF-α、IL-6)表达明显增加(P<0.05),肝汇管区巨噬细胞CD11b+聚集明显增加,肝组织损伤加重。[结论]1、参照Nauta RJ等的方法成功制备了大鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型,其操作简单、手术安全,适合缺血再灌注损伤的研究。2、CoPP干预能够诱导HO-1的高表达,减轻肝脏缺血再灌注损伤；ZnPP干预可抑制HO-1的表达,加重肝脏缺血再灌注损伤。3、TLR4参与了肝缺血再灌注损伤,并与HO-1在肝缺血再灌注损伤中关系密切,推测TLR4是HO-1的一种潜在性阻碍剂。HO-1作用于TLR4的可能机制是：CoPP通过上调HO-1表达,抑制TLR4下游TRIF依赖信号通路,削弱TLR4/TRIF/IRF3/1型IFN信号通路的传导,从而减轻肝缺血再灌注损伤。ZnPP预处理则抑制HO-1表达,加重肝缺血再灌注损伤。