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研究背景自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)是一种病因不明的慢性炎症性肝病,特征表现为血清转氨酶升高,高γ球蛋白血症(主要以IgG增高为主),血清出现ANA、SMA等自身抗体。AIH的组织病理学特征表现为含淋巴细胞,巨噬细胞和浆细胞的免疫炎症细胞浸润肝组织导致的肝门周围或间隔周围界面性肝炎。此病女性多见(男女比例为1:3.6),任何年龄均可发病,但以18～29岁和40～60岁为两个发病高峰。基于血清免疫学的进展,目前AIH的分型如下:1型AIH(AIH-1)和2型AIH(AIH-2)。1型AIH与抗核抗体(ANA)、平滑肌抗体(SMA)、抗中性粒细胞胞浆抗体核周型(p-ANCA)有关。2型AIH临床较少见,以抗肝/肾微粒体抗体1型(抗LKM-1)阳性为特点。AIH经皮质类固醇和(或)其它免疫抑制剂治疗可使65%患者的临床、生化、组织学等方面的损害得到缓解。因此,早期确诊、及时治疗可以提高AIH患者的生存率。尽管自身反应性T细胞针对自身肝细胞的自身免疫反应被认为参与AIH的发病机制,但AIH肝内免疫学反应的具体机制仍不清楚。PD-1/PD-L(Programmeddeath-1/programmed death-1 ligands)是新近发现的共刺激分子,属于CD28/B7家族成员,两者之间的相互作用可提供淋巴细胞活化的抑制信号,在免疫活化和耐受中起关键作用。研究证实PD-1/PD-L1、L2体系在多种自身免疫性疾病中发挥免疫调节作用。国外文献报道,AIH患者肝脏中PD-1/PD-L1、L2基因的mRNA表达水平均增高,但是PD-L2与PD-1的相对表达水平在AIH中有所降低,提示AIH中PD-L2的调控可能受损。本研究采用C57BL/6小鼠动物模型检测PD-1/PD-L1、L2基因在AIH中的表达水平,并研究其与IL-4、IFN-γ和TNF-α3种炎症性细胞因子之间的关系,进一步揭示PD-1分子及上述细胞因子在肝脏自身免疫性炎症中的相互作用。此外,研究证实,TNF-α在诱导AIH肝脏损伤中发挥重要作用。以TNF-α为靶向的肿瘤坏死因子α拮抗剂是一种新型的生物制剂,其通过拮抗TNF-α的作用,从而发挥抑制炎症反应,延缓病情进展的药物治疗作用。近年来已在多种风湿性疾病中得到应用,并且疗效显著。本研究比较用药前后血清肝脏转氨酶水平、肝脏病理学变化,以及应用RT-PCR方法检测用药前后TNF-α,TRAF-1和TRAF-2基因表达水平的变化,探讨TNF-α在自身免疫性肝炎中的作用,初步探索肿瘤坏死因子α拮抗剂对于自身免疫性肝炎的治疗效果,为临床用药提供一定的实验室基础。第一部分:C57BL/6小鼠自身免疫性肝炎模型的建立与鉴定目的:建立自身免疫性肝炎的动物模型,在此基础上探讨AIH的发病机制及新药疗效。方法:以同种系肝抗原(S-100)和完全氟氏佐剂两次腹腔注射免疫C57BL/6小鼠建立AIH的动物模型,正常对照组采用同剂量的PBS缓冲液,并于免疫后第4周末处死小鼠,检测血清转氨酶水平,自身抗体ANA和SMA以及肝组织病理检查,并与正常对照组进行比较。结果:病理模型组小鼠一般状况差,体重增长不明显(p=0.000),免疫后第4周检测血清肝脏转氨酶,发现ALT和AST较正常组明显升高(ALT:47.63±7.45 v.s19.95±0.99,p=0.001;AST:248.37±21.25 v.s.93.00±16.61,p=0.000),部分小鼠血清中出现ANA阳性,阳性率为26.7%,未检出SMA阳性,肝组织病理学检测可见汇管区大量炎症性细胞浸润,以淋巴细胞和浆细胞为主,肝细胞可见点片状坏死。结论:以同种系肝抗原和完全氟氏佐剂两次腹腔注射免疫C57BL/6小鼠建立的实验性自身免疫性肝炎动物模型,免疫后第4周即出现人类AIH的实验室和病理特点,表明建模成功。第二部分:PD-1/PD-L1,L2在自身免疫性肝炎发病中的作用研究目的:研究PD-1(programmed death-1)/PD-L1、L2(programmed death-1 ligand1、2)在自身免疫性肝炎(AIH)发病及炎症进展中的作用。方法:建立AIH的C57BL/6小鼠动物模型,应用RT-PCR的方法检测小鼠肝脏中PD-1、PD-L1、L2的表达水平,同时检测小鼠脾脏中IFN-γ/、TNF-α及IL-4等细胞因子的表达水平,并与正常对照组进行比较。结果:PD-1、PD-L1、PD-L2在AIH动物模型组中的表达水平均明显高于正常对照组(p＜0.05),IFN-γ、TNF-α及IL-4的表达水平亦明显升高(p＜0.05),并且PD-L1的表达与IFN-γ(r=0.289,P＜0.05)呈正相关,而PD-L2与IL-4(r=0.378,P＜0.01)及IFN-γ,(r=0.261,P＜0.05)之间均存在相关性。PD-L1、PD-L2与TNF-α之间无相关性。结论:PD-1/PD-L1、L2在AIH动物模型肝脏中的表达水平明显增高,并与增高的IFN-γ及IL-4之间存在相关性,推测PD-1及其配体在AIH发病及其病情进展中发挥一定的作用。第三部分:肿瘤坏死因子拮抗剂治疗AIH的初步研究目的:应用肿瘤坏死因子α拮抗剂对自身免疫性肝炎C57BL/6小鼠模型进行干预,初步探索肿瘤坏死因子拮抗剂对于自身免疫性肝炎的疗效。方法:建立AIH的C57BL/6小鼠动物模型,应用肿瘤坏死因子α拮抗剂——益赛普0.1mg/0.2mg分别于第一次免疫后2周和4周时皮下注射,2次/周×4周,检测血清肝脏转氨酶水平,肝组织病理学检测,RT-PCR方法检测药物处理组脾脏TNF-α,肝脏中PD-1、PD-L1、L2及TRAF-1和TRAF-2基因表达水平的变化,并与病理对照组和正常对照组之间进行比较。结果:应用益赛普后,血清肝脏转氨酶水平呈下降趋势,但经统计学分析,并无显著性差异(p＞0.05);肝组织病理检测结果显示肝组织炎症在用药后有所改善;肝脏PD-1表达水平较病理对照组明显下降(p=0.000),而PD-L1,L2无明显变化。肝脏TNF-α表达水平在用药后明显降低(p=0.019)。与正常对照组相比,病理对照组TRAF-1表达水平升高,但无统计学意义(p=0.422),TRAF-2基因表达水平反而明显降低(p=0.007);应用益赛普治疗后,TRAF-1的表达上调,与病理对照组相比无显著性差异(p=0.422),而TRAF-2基因表达水平明显升高(p=0.015)。TRAF-2与TNF-α之间存在着正相关性(r=0.261,p=0.044)。结论:TNF-α、TRAF-1和TRAF-2均参与AIH的肝脏炎症反应过程,TNF-α可能成为今后AIH治疗的新靶点,而TNF-α拮抗剂今后可能应用于AIH的临床治疗。