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前言 本研究组于2001年克隆的人α-1B糖蛋白前体基因(α-1Bglycoprotein precursor gene,α-1BGP)，全长1.6kb，编码495个氨基酸。此基因的功能至今仍不清楚。通过同源分析、基因表达谱分析及结构域分析，推测α-1B糖蛋白可能在细胞的增殖过程中起作用。本研究是在原有研究的基础上，应用重组人生长激素(GH)、雌激素(β-E2)及脂多糖(LPS)处理人肝癌细胞，检测对α-1BGP的转录调控作用；通过基因转染的方法，观察α-1BGP对细胞增殖的影响；最后构建pPIczαA-α-1BGP表达载体，将其转染入毕式酵母GS115菌株，从而获得分泌的重组人α-1B糖蛋白，为进一步研究其蛋白功能奠定基础。 实验材料与方法 实验材料 1．细胞培养相关试剂 2．Northern杂交和Western Blot相关试剂 3．Marathon-ReadyTM cDNA Kit和EasySelectTM Pichia Expression Kit 4．pcDNA3.1-α-1BGP及pPIczαA-α-1BGP载体构建相关分子生物学试剂 5．流式细胞仪相关试剂 实验方法 分别应用6nmol／L的GH、10nmol／L的β-E2及10mg／mlLPS处理培养的人肝癌BEL-7402细胞系，在不同时段收集细胞，用Northern杂交分析检测这几种因素对α-1BGP表达的调节作用。TRANSFAC4．0软件和softbeny网站上hSG，hSH，NSITE软件共同分析 a－IBGP的 5’上游调控区。构建了 pcDNA3．l－a－IBGP的真核细胞表达载体，并用磷酸钙共沉淀法转染细胞，Northern印迹杂交分析转染后 a－IBGP的表达，流式细胞仪分析细胞周期，检测aJBGP对细胞增殖的影响。另构建了pPIczaA－a叫 酵母表达载体，转化GSlls菌株，确定表型，PCR筛选a－IBGP有效整合酵母基因组的菌株，进行诱导表达，SDS一PAGE凝胶电泳和Western Blot鉴定表达产物。 实验结果 GH、p－EZ及IyS处理人肝癌BEL－7402细胞后，No汕em印迹杂交分析均显示 a则 与对照组相比表达增高。TRANS－FAC4．0软件和softbeny网站上TSSG，TSSH，NSI’fE软件共同分析，在a—IBGP转录起始点上游J 到一198区域存在TATA盒，在其附近及其5’上游远端调节区存在多个API，C／EBP结合位点，并且在转录起始点上游人 到一 处存在一个 C－FOS结合基序。成功构建了 pcDNA3．l－a则 表达载体，Northern印迹杂交显示转染 72 ／J’时后，a刁 表达明显增高。细胞周期分析显示转染72小时后的细胞，与对照组相比对指数增高，GO／GI期细胞减少，S期细胞增多，GZ／M期细胞增高不明显。成功的构建了 pPIczaA－a－IBGP表达载体，用线性 pPIczaA－。－IBGP及pPIc加质粒转染毕式酵母GSlls 菌株，提取GSlls－a叫 酵母 DNA，PCR扩增，电泳结果表明 a则 已有效地整合酵母基因组中。诱导表达后对表达产物进行鉴定，SDS－PAGE电泳结果在分子量 66．2－43 KDa之间有一条逐渐增加的带，在第7天达到最强，分子量接近预测大小门4．ZKDa人West－em－Blot结果在 66．2－43KDa之间可见一条微弱的特异性带，而对照组未见。 ·2· 讨”论 人 a一 糖蛋白前体基因（a－IBGP）自克隆以来关于它的功能及在人类疾病中所发挥的作用一直都不清楚。我们利用生长激素（GH）处理肝癌 BEL－7442细胞系，a－IBGP的表达明显高于对照组，说明 GH可以调节 a－IBGP的表达，该基因可能参与GH的生理功能及在与GH相关的疾病中发挥作用。GH对基因的调节，一部分是直接作用的，而另外一部分是通过转录因子的诱导表达，与其有关联的顺式作用元件的结合后，改变基因的转录水平。为了了解 GH是通过何种途径调节 a－IBGP表达，我们分析了 a－IBGP的 5’端调控区，台果发现了普遍存在的 API，C／EBP结合基序，而且还存在着一个（，－fOS结合基序，所以推测GH可能通过诱导 c－fos，c一 表达增高，结合于 a－IBGP调控区的特异性 DNA反应元件，促进它的表达。有研究发现血清中人 a河糖蛋白在绝经前女性中的含量比同年龄段的男性高。而GH的分泌在人类中存在性别差异，女性表现了较高的基础水平。所以可能是由于 GH分泌的性别差异，a—IBGP在不同水平 GH的调节下表达不同，导致了人a－IB糖蛋白血清中含量的性别不同。因此 a人 可能是一种新的依靠性别特异分泌模式的生长激素靶基因，参与GH在不同性别中的特异作用。 我们采用基因转染结合流式细胞仪的方法分析细胞周期，结果显示转染之后的细胞，GO／GI期细胞减少／期细胞和PI指数均有增加，说明了 a－IBGP对体外培养的肝细胞具有增殖作用，可能是触发细胞通过m期限．制点，进人S期，而发挥增殖作用的。我们的研究还发现GH、雌激素和e都可以在体外培养的 ·3·细胞中诱导a－IBGP表达增高，说明其是几种不同因素作用于细胞，触发不同途径的共有的下游基因，所以它可能对这几种因素的相似功能起一定的作用。而以往的研究表明GH、雌激?