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鞭毛是沙门菌运动性的基础结构,鞭毛蛋白是鞭毛丝状部组成元件。鞭毛蛋白被认为是一种保护性抗原用于针对沙门菌的疫苗研究,同时它还是Toll样受体5(Toll-like receptor 5, TLR5)的配体,与之结合后可诱导产生天然免疫应答。近年来研究结果表明,鞭毛蛋白作为天然免疫应答的诱导剂,诱导产生的天然免疫应答可帮助建立针对外源抗原的获得性免疫应答,从而显示出鞭毛蛋白作为免疫佐剂的特性。禽流感(Avian influenza, AI)是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的一种禽类的急性高度接触性、致死性传染病,被国际兽疫局(OIE)列为法定通报疾病。由于近年来包括H5N1亚型在内的一些禽流感病毒能够跨种感染人并引起人类疾病,所以引起了各国医学和兽医学界的广泛关注。基质蛋白2(M2)是禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)表面的第三大跨膜蛋白,它在禽流感病毒各亚型的不同毒株之间都具有很高的同源性。研究结果表明,M2蛋白具有较好的抗原性,且其主要抗原决定簇位于M2蛋白的胞外区M2e。新城疫(Newcastle disease, ND)是危害养禽业的主要传染病之一,被OIE确定为法定通报疾病,免疫预防是控制该病的重要手段之一。位于新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)囊膜上的融合蛋白(F)除了参与病毒的穿透、细胞融合,与病毒的致病性有关外,还具有良好的免疫原性,是NDV主要的保护性抗原。为此,本研究以鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白作为研究对象,构建了展呈AIV M2e表位的重组嵌合鞭毛蛋白,以及鞭毛蛋白与NDV F蛋白部分表位串联表达的融合蛋白,并分别对它们的免疫原性进行了初步的分析,以期分析该鞭毛蛋白的免疫佐剂效应。1.鞭毛蛋白展呈禽流感病毒M2e表位及其免疫原性分析以重组质粒pET-fliC为模板,应用引物fliC-A、fliC-C扩增fliC基因上游部分fliC-AC;引物fliC-D、fliC-B扩增fliC基因下游部分fliC-DB;人工合成两个拷贝的H5N1亚型禽流感病毒M2e(aa 2-24)表位基因M2e2,利用overlap PCR技术,以fliC-AC和M2e2基因为模板,应用引物fliC-A、M2-F扩增fliC-AC-M2e2基因片段;最后以fliC-AC-M2e2和fliC-DB为模板,应用引物fliC-A、fliC-B扩增嵌合基因片段fliC/M2e2,从而将M2e2基因插入沙门菌鞭毛蛋白基因fliC高变区。将嵌合基因片段fliC/M2e2克隆到质粒pET30a+上,获得重组质粒pET-fliC/M2e2。将质粒pET-fliC/M2e2通过电转化法转化鼠伤寒沙门菌LB5000,重组菌命名为LB5000(fliC/M2e2)。应用P22噬菌体转导技术,将fliC/M2e2基因导入都柏林沙门菌SL5928的基因组中,对初筛具有运动性的转导菌进行PCR鉴定,以转导菌全基因组为模板,扩增fliC/M2e2基因和M2e2基因;PCR鉴定结果阳性的转导菌再穿刺半固体培养基,进行动力学分析并对转导菌进行透射电镜观察;动力学分析结果阳性的转导菌再进行生化鉴定和血清学鉴定;最后,提取鉴定结果阳性的转导菌的鞭毛蛋白,以鼠抗鼠伤寒沙门菌fliC鞭毛蛋白多抗血清为一抗,对提取的鞭毛蛋白进行Western blot分析。将以上所有鉴定结果均为阳性的转导菌命名为SL5928(fliC/M2e2)。提取重组菌SL5928(fliC/M2e2)的重组嵌合鞭毛蛋白fliC/M2e2,以50μg/只的剂量通过皮下注射途径免疫C3H/HeJ小鼠。ELISA检测各免疫组小鼠针对M2e2蛋白的特异性血清抗体,并对结果进行统计学分析。结果显示,二免第14天,fliC/M2e2鞭毛蛋白免疫组的抗体效价与空白对照组之间呈现显著性差异(P <0.05),fliC鞭毛蛋白免疫组和M2e蛋白免疫组与空白对照组之间不呈现显著性差异(P >0.05)。说明本研究所构建的fliC/M2e2嵌合基因能够在沙门菌中表达,且表达的重组嵌合鞭毛蛋白fliC/M2e2能诱导机体产生针对M2e表位的特异性血清抗体。2.鞭毛蛋白与新城疫病毒F蛋白的融合表达及其产物对小鼠的免疫原性分析以重组质粒pET-fliC为模板,应用引物FF1、FF2扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因;以重组质粒pVAX1-F为模板,应用引物FF3、FF4扩增含有新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)F蛋白部分表位的基因片段F(aa 147-344);通过柔性肽(Gly4Ser)2编码基因将fliC基因和F基因串联,获得fliC-F基因片段;将fliC-F基因克隆到原核表达质粒pET30a+上,获得重组原核表达质粒pET-fliC-F。将重组原核表达质粒pET-fliC-F转化原核表达菌E.coli BL21(DE3),获得重组原核表达菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)。对重组原核表达菌BL21(DE3)(pET-fliC-F)进行诱导表达,对表达蛋白进行变性、复性、透析和浓缩,获得可溶性fliC-F融合蛋白。以鼠抗fliC蛋白或鼠抗F蛋白多抗血清作为一抗,对fliC-F融合蛋白进行Western blot分析。分析结果显示,两种多抗血清均能特异性识别fliC-F融合蛋白。说明,fliC-F融合蛋白中的fliC蛋白和F蛋白成分能独立地保持各自的天然构象。将fliC-F融合蛋白以100μg/只的剂量,通过皮下注射途径免疫C3H/HeJ小鼠。ELISA检测各免疫组小鼠针对F蛋白的特异性血清抗体,并对结果进行统计学分析。结果显示,二免第14天和二免第21天,fliC-F蛋白免疫组的抗体效价与空白对照组之间呈现显著性差异(P <0.05);二免第14天,F蛋白油乳剂免疫组的抗体效价与空白对照组之间也呈现显著性差异(P <0.05);F蛋白免疫组和fliC蛋白免疫组与空白对照组之间,在各阶段均不呈现显著性差异(P >0.05)。结果说明,本研究中原核表达的fliC-F融合蛋白能诱导C3H/HeJ小鼠产生针对F蛋白的特异性血清抗体。