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晶状体纤维化疾病，如前囊膜下白内障(Anterior Subcapsular Cataract，ASC)和后囊膜混浊(Posterior Capsular Opacification，PCO)是常见的白内障和视力损害病变。越来越多的证据表明ASC和PCO具有许多类似的分子特征，如晶状体上皮细胞(LECs)的异常增殖，迁移和上皮间质转分化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)。EMT指上皮细胞失去细胞极性和细胞-细胞粘附能力，获得迁移和侵袭的特性，并成为间质细胞。该特定过程存在于胚胎发育，伤口愈合和组织修复以及肿瘤转移中。EMT由各种生物分子和信号通路引发，如转化生长因子-β(Transforminggrowthfactor-β，TGF-β)、胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)、c-Src激酶、转录因子snail和PI3K/Akt/mTOR/NF-κB信号传导等。文献报道及我们课题组前期研究发现多种刺激因素可能通过激活c-Src激酶，参与晶状体上皮细胞EMT过程。c-Src是Src家族酪氨酸激酶(Src family tyrosine kinases ，SFKs)之一，通过Tyr419的磷酸化或Tyr530的去磷酸化来激活。c-Src的激活是细胞分化，迁移和细胞间连接变化所必需的，尤其在EMT过程中。c-Src激酶信号调控机制是一个多因素、多机制、复杂的信息交换，这些相互作用机制共同调控细胞的生长、迁移、分化和凋亡。在本研究中，我们推测活化的c-Src激酶可能是晶状体上皮细胞EMT的触发因素，并提出假设：活化的c-Src一方面通过上调凋亡抑制基因的表达，促进细胞存活；另一方面通过直接启动晶状体EMT相关转录因子的表达并诱发EMT，从而诱导晶状体纤维化病变(ASC和PCO)的发生。
目的：
1.构建c-Src突变表达载体pcDNA3.1-c-SrcY530F，转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，提高c-Src激酶活性；探讨活化c-Src激酶对EMT标志物表达水平及对细胞移行、增殖能力的影响及调控。
2.构建c-Src干涉表达载体pSilencer4.1-ShSrc，转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，抑制HLE-B3细胞c-Src激酶活性；探讨抑制c-Src激酶活性对EMT标志物表达水平及对细胞移行、增殖能力的的影响及调控。
3.探讨c-Src激酶的活性变化对人晶状体上皮细胞凋亡水平的影响。
方法：
1.利用点突变原理，设计Y530突变引物，扩增获得突变的c-Src基因的CDS区，连接到pcDNA3.1真核表达载体，构建c-Src突变表达载体pcDNA3.1-c-SrcY530F，转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，检测p-Src419表达水平，即c-Src激酶的活性水平。
2.在c-Src激酶激活的HLE-B3细胞，通过Real-TimePCR及WesternBlot方法检测EMT标志物E-cadherin、ZO-1、α-SMA和Vimentin在mRNA及蛋白水平的表达；Transwell及划痕实验检测细胞移行能力；MTT法检测细胞增殖能力。
3.利用RNA干扰技术设计并构建c-Src干涉表达载体pSilencer4.1-ShSrc，转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，沉默c-Src激酶的表达，抑制c-Src激酶活性。
4.在c-Src激酶活性抑制的HLE-B3细胞，通过Real-TimePCR及WesternBlot方法检测EMT标志物E-cadherin、ZO-1、α-SMA和Vimentin在mRNA及蛋白水平的表达；Transwell及划痕实验检测细胞移行能力；MTT法检测细胞增殖能力。
5.用Real-TimePCR及WesternBlot方法分别检测c-Src活化及活性抑制后对HLE-B3细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL、Bak和Caspase-3的mRNA及蛋白水平表达调控及影响；流式细胞仪检测c-Src活化及活性抑制后表达对HLE-B3细胞凋亡的影响。
结果：
1.用成功构建c-Src突变表达载体pcDNA3.1-c-SrcY530F转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，c-Src激酶活性(p-Src419蛋白)增高，与空白质粒对照组相比具有显著统计学差异(P＜0.01)；用成功构建c-Src干涉表达载体pSilencer4.1-ShSrc转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，c-Src激酶蛋白及活性降低，与对照组相比具有显著统计学差异(P＜0.01)。
2.在c-Src激酶活化的人晶状体上皮细胞中，EMT过程中的上皮细胞标志物E-cadherin和ZO-1在mRNA及蛋白水平的表达降低，而间质细胞标志物α-SMA和Vimentin的表达均上调，与对照组相比具有显著统计学差异(P＜0.01)，提示活化c-Src激酶促进晶状体上皮细胞的EMT过程；通过Transwell及划痕实验发现活化c-Src激酶可促进HLE-B3细胞的移行能力，24小时和48小时c-Src活化组细胞穿过小室的细胞数量高于空白对照组71%和152.8%，具有显著统计学差异(P＜0.01)；c-Src活化组细胞的相对迁移率在24小时和48小时分别高于空白质粒对照组84%和60%，具有显著统计学差异(P＜0.01)。通过MTT增殖实验与空白质粒对照组相比，活化c-Src激酶HLE-B3细胞的增殖率在12，24，48及72小时分别提高了9%,9%,25%和39%，而48和72小时的增殖率较对照组有显著差异(P＜0.01)。
3.抑制c-Src激酶活性，人晶状体上皮细胞EMT过程中上皮细胞标志物E-cadherin和ZO-1在mRNA及蛋白水平的表达升高，而间质细胞标志物α-SMA和Vimentin的表达均下调，与对照组相比具有显著统计学差异(P＜0.01)，提示抑制c-Src激酶活性能够抑制晶状体上皮细胞的EMT过程；Transwell实验发现抑制c-Src激酶活性HLE-B3细胞的移行能力在24及48小时穿过小室的细胞数量低于空白对照组31.5%和41.6%，具有显著统计学差异(P＜0.01)；细胞划痕实验显示抑制c-Src活性组细胞的相对迁移率在24小时和48小时分别低于空白质粒对照组63%和62%，具有显著统计学差异(P＜0.01)。MTT实验发现与空白对照组相比抑制c-Src激酶活性HLE-B3细胞的增殖率在24，48及72小时分别下降了2%,7%和13%，48和72小时的下降程度与对照组相比具有统计学差异(P＜0.05)。
4.活化c-Src激酶，人晶状体上皮细胞HLE-B3中凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-XL的mRNA及蛋白水平表达上调，而凋亡蛋白Bak和Caspase-3表达均下调，与对照组相比差异均具有显著统计学差异(P＜0.01)；抑制c-Src活性，HLE-B3细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-XL的mRNA及蛋白水平表达均下调，凋亡蛋白Bak的表达上调，Caspase-3表达升高，且Caspase-3被激活，与对照组相比差异均具有显著统计学意义(P＜0.01)；流式细胞仪检测发现活化c-Src激酶组HLE-B3细胞的凋亡率(0.25%)与对照组(0.01%)相比无统计学差异(P＞0.05)，而抑制c-Src激酶活性组HLE-B3细胞的凋亡率(25.59%)明显高于对照组(11.59%)((P＜0.01)。
结论：
1.活化c-Src激酶促进人晶状体上皮细胞HLE-B3EMT进程。
2.活化c-Src激酶促进HLE-B3移行及增殖。
3.活化c-Src激酶抑制人晶状体上皮细胞HLE-B3凋亡。
目的：
1.构建c-Src突变表达载体pcDNA3.1-c-SrcY530F，转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，提高c-Src激酶活性；探讨活化c-Src激酶对EMT标志物表达水平及对细胞移行、增殖能力的影响及调控。
2.构建c-Src干涉表达载体pSilencer4.1-ShSrc，转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，抑制HLE-B3细胞c-Src激酶活性；探讨抑制c-Src激酶活性对EMT标志物表达水平及对细胞移行、增殖能力的的影响及调控。
3.探讨c-Src激酶的活性变化对人晶状体上皮细胞凋亡水平的影响。
方法：
1.利用点突变原理，设计Y530突变引物，扩增获得突变的c-Src基因的CDS区，连接到pcDNA3.1真核表达载体，构建c-Src突变表达载体pcDNA3.1-c-SrcY530F，转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，检测p-Src419表达水平，即c-Src激酶的活性水平。
2.在c-Src激酶激活的HLE-B3细胞，通过Real-TimePCR及WesternBlot方法检测EMT标志物E-cadherin、ZO-1、α-SMA和Vimentin在mRNA及蛋白水平的表达；Transwell及划痕实验检测细胞移行能力；MTT法检测细胞增殖能力。
3.利用RNA干扰技术设计并构建c-Src干涉表达载体pSilencer4.1-ShSrc，转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，沉默c-Src激酶的表达，抑制c-Src激酶活性。
4.在c-Src激酶活性抑制的HLE-B3细胞，通过Real-TimePCR及WesternBlot方法检测EMT标志物E-cadherin、ZO-1、α-SMA和Vimentin在mRNA及蛋白水平的表达；Transwell及划痕实验检测细胞移行能力；MTT法检测细胞增殖能力。
5.用Real-TimePCR及WesternBlot方法分别检测c-Src活化及活性抑制后对HLE-B3细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL、Bak和Caspase-3的mRNA及蛋白水平表达调控及影响；流式细胞仪检测c-Src活化及活性抑制后表达对HLE-B3细胞凋亡的影响。
结果：
1.用成功构建c-Src突变表达载体pcDNA3.1-c-SrcY530F转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，c-Src激酶活性(p-Src419蛋白)增高，与空白质粒对照组相比具有显著统计学差异(P＜0.01)；用成功构建c-Src干涉表达载体pSilencer4.1-ShSrc转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，c-Src激酶蛋白及活性降低，与对照组相比具有显著统计学差异(P＜0.01)。
2.在c-Src激酶活化的人晶状体上皮细胞中，EMT过程中的上皮细胞标志物E-cadherin和ZO-1在mRNA及蛋白水平的表达降低，而间质细胞标志物α-SMA和Vimentin的表达均上调，与对照组相比具有显著统计学差异(P＜0.01)，提示活化c-Src激酶促进晶状体上皮细胞的EMT过程；通过Transwell及划痕实验发现活化c-Src激酶可促进HLE-B3细胞的移行能力，24小时和48小时c-Src活化组细胞穿过小室的细胞数量高于空白对照组71%和152.8%，具有显著统计学差异(P＜0.01)；c-Src活化组细胞的相对迁移率在24小时和48小时分别高于空白质粒对照组84%和60%，具有显著统计学差异(P＜0.01)。通过MTT增殖实验与空白质粒对照组相比，活化c-Src激酶HLE-B3细胞的增殖率在12，24，48及72小时分别提高了9%,9%,25%和39%，而48和72小时的增殖率较对照组有显著差异(P＜0.01)。
3.抑制c-Src激酶活性，人晶状体上皮细胞EMT过程中上皮细胞标志物E-cadherin和ZO-1在mRNA及蛋白水平的表达升高，而间质细胞标志物α-SMA和Vimentin的表达均下调，与对照组相比具有显著统计学差异(P＜0.01)，提示抑制c-Src激酶活性能够抑制晶状体上皮细胞的EMT过程；Transwell实验发现抑制c-Src激酶活性HLE-B3细胞的移行能力在24及48小时穿过小室的细胞数量低于空白对照组31.5%和41.6%，具有显著统计学差异(P＜0.01)；细胞划痕实验显示抑制c-Src活性组细胞的相对迁移率在24小时和48小时分别低于空白质粒对照组63%和62%，具有显著统计学差异(P＜0.01)。MTT实验发现与空白对照组相比抑制c-Src激酶活性HLE-B3细胞的增殖率在24，48及72小时分别下降了2%,7%和13%，48和72小时的下降程度与对照组相比具有统计学差异(P＜0.05)。
4.活化c-Src激酶，人晶状体上皮细胞HLE-B3中凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-XL的mRNA及蛋白水平表达上调，而凋亡蛋白Bak和Caspase-3表达均下调，与对照组相比差异均具有显著统计学差异(P＜0.01)；抑制c-Src活性，HLE-B3细胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-XL的mRNA及蛋白水平表达均下调，凋亡蛋白Bak的表达上调，Caspase-3表达升高，且Caspase-3被激活，与对照组相比差异均具有显著统计学意义(P＜0.01)；流式细胞仪检测发现活化c-Src激酶组HLE-B3细胞的凋亡率(0.25%)与对照组(0.01%)相比无统计学差异(P＞0.05)，而抑制c-Src激酶活性组HLE-B3细胞的凋亡率(25.59%)明显高于对照组(11.59%)((P＜0.01)。
结论：
1.活化c-Src激酶促进人晶状体上皮细胞HLE-B3EMT进程。
2.活化c-Src激酶促进HLE-B3移行及增殖。
3.活化c-Src激酶抑制人晶状体上皮细胞HLE-B3凋亡。