细胞融合是指两个或两个以上的亲代细胞通过发生细胞膜融合、细胞质混合甚至细胞核融合后形成杂交细胞的现象。通过细胞融合,子代细胞具有双亲代细胞的表型。细胞融合能够促进肿瘤细胞发生侵袭、转移,对肿瘤的发展具有重要意义。同时,肿瘤微环境的建立,对肿瘤的生存及发展具有重要作用。然而,肿瘤微环境和细胞融合在肿瘤的发展过程中的具体作用并未得到证实,其调控作用及机制目前尚不清楚。肿瘤微环境与肿瘤的进展密切相关。目前研究证实,低氧使得肿瘤发生EMT,从而能够上皮样细胞的极性发生改变,上皮特异性蛋白E-钙黏素(E-Cad)表达降低而间质特异性蛋白N-钙黏素(N-Cad)表达增加,使得癌细胞在细胞与细胞之间的束缚降低,肿瘤细胞从瘤体上脱落,更加利于肿瘤细胞的转移,这和细胞融合状态表现是类似的。有学者将两者之间的联系一起进行讨论,但缺乏相关实验的支撑。细胞外囊泡是细胞膜源性的细胞释放的囊性结构,其内包含了大量的生物活性物质(如蛋白、RNA、脂类等),对靶细胞的调节具有重要作用,有助于塑造和改造肿瘤微环境。可以按尺寸来区分可以分为:20-100nm的外泌体和100-1OOOnm的微囊泡。作为肿瘤微环境的一员,对肿瘤的增殖、侵袭、转移都有重要作用。微环境中的间质细胞可以接受肿瘤细胞释放的囊泡,从而改变自己以适应肿瘤的增殖、侵袭、转移。内皮细胞是重要的一类间质细胞,肿瘤的血性转移必须破坏血管内皮的完整性,从而有位置予以肿瘤细胞生长或者转移进入血管腔内。一方面可以通过肿瘤的直接接触或者间接接触改变内皮的极性,从而破坏了内皮的完整性,也可以通过肿瘤细胞和内皮细胞融合,直接破坏内皮细胞的完整性。肿瘤源性微囊泡可以将内皮细胞改造成更加适合与肿瘤细胞融合的状态,一方面增加细胞融合的可能性,直接破坏血管内皮的完整性,一方面也改变了内皮细胞的极性,两者都为肿瘤的转移提供了便利。本研究通过观察低氧及微囊泡对口腔鳞癌细胞和黏膜上皮细胞或者内皮细胞融合中的作用,并进一步探讨低氧促进细胞融合的可能作用机制。第一部分低氧促进CAL-27/HIOEC融合的初步研究目的:探讨低氧对口腔鳞癌细胞与人永生化上皮细胞(HIOEC)融合的调控作用,及EMT在其中所起的作用。方法:利用慢病毒空载体将口腔鳞癌细胞系CAL-27及人永生化上皮细胞分别转染红色荧光蛋白(RFP-)及绿色荧光蛋白(GFP-)。将两者转染72小时后,通过嘌呤霉素和流式细胞荧光分选技术(FACS)筛选出荧光强度较为稳定的细胞株:染有红色荧光的CAL-27(RFP-CAL-27)以及染有绿色荧光的HIOEC(GFP-HIOEC);然后将等量的RFP-CAL-27和GFP-HIOEC共培养,利用普通荧光显微镜(FM)观察细胞融合情况及计数;在共聚焦专用观察皿内共培养RFP-CAL-27和GFP-HIOEC3天,固定后利用DAPI染色细胞核,通过激光扫描共聚焦荧光显微镜(LSCM)观察融合细胞形态。将等量的GFP-HIOEC与RFP-CAL-27在1.0%02,37℃培养箱共培养,连续观察。分别在第1、3天,随便选取6个视野,利用人工计数法(Artificial Cell Counting)分别计算出低氧实验组及对照组融合细胞的数目;并在共培养的第3天,利用流式细胞仪技术(FACS),计算出两组共培养体系的细胞融合率,从而探究低氧对CAL-27与HIOEC细胞融合的影响。将HIOEC在低氧培养箱(1.0%O2,37℃)培养24小时后,提取蛋白,进行Western Blot检测,检测EMT指标。并将GFP-HIOEC在低氧培养箱(1.0%O2,37℃)培养24小时后,再与RFP-CAL-27在常氧环境下共培养3天,采用人工计数法和流式细胞术检测融合细胞率。再予以低氧及(或)DAPT(EMT的一种阻滞剂),并再次检测EMT指标,并采用人工计数法和流式细胞术检测融合细胞率。结果:1.FM观察结果显示:CAL-27与HIOEC能够发生自发融合,融合细胞呈现橙色荧光,且荧光强度较为稳定。2.LSCM观察结果显示:融合细胞胞膜完整,无皱缩及发泡现象;核膜完整,细胞核无固缩现象。3.人工计数法统计结果表明:两组共培养体系中融合细胞数目都随着时间的变化而增加;而低氧实验组的融合细胞数目明显多于对照组,约1.5-2倍(P<0.05)。4.FACS实验结果显示:实验组细胞融合率为0.85%±0.06%,而对照组融合率为0.39%±0.08%。两组实验结果的差异具有明显的统计学意义(P<0.05)。5.通过低氧预处理后,HIOEC可以发生EMT。人工计数和FACS统计分析发现低氧预处理组较对照组,具有更高的融合率。6.通过DAPT部分阻断EMT后,其融合率也明显下降。结论:综合FM,LSCM,人工计数法与FACS分析结果,证实了 口腔鳞癌细胞CAL-27与人永生化上皮细胞HIOEC能够发生自发融合。低氧能介导CAL-27与HIOEC细胞融合。EMT是低氧介导二者融合增效作用的一种机制。第二部分微囊泡调控CAL-27/HUVEC融合的机制研究目的:探讨微囊泡对CAL-27和HUVEC细胞融合的影响,并探究VCAM-1在微囊泡促进CAL-27与HUVEC融合中的潜在作用。方法:差速离心法提取CAL-27释放的微囊泡(TMVs),通过扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、动态光散射等方法验证TMVs。将TMVs加入到RFP-CAL-27与GFP-HUVEC的共培养体系,共培养3天后,采用人工计数法和FACS分别统计融合细胞数和细胞融合率。将TMVs与HUVEC共培养,分别于6、12、24h通过实时逆转录PCR技术(quantitative Real-time RT-PCR)检测 VCAM-1mRNA 的表达量。使用siRNA干扰GFP-HUVEC中的VCAM-1的表达,将TMVs加入(或不加)到siRNA干扰后的GFP-HUVEC(或无干扰的GFP-HUVEC)与RFP-CAL-27的共培养体系中,连续观察3天,在第1、3天利用人工计数法计算融合细胞数目;并利用FACS检测第三天的细胞融合率。结果:1.人工计数法和FACS结果显示:TMVs刺激组较对照组,融合细胞数和细胞融合率的差异均有统计学意义(p<0.05)。2.RT-PCR显示:TMVs刺激后,VCAM-1的表达增加,且在第6h时,达到峰值。3.VCAM-1沉默后,利用人工计数法计算融合细胞数量。结果显示siRNA干扰组融合细胞数明显低于对照组(P<0.05)。FACS结果显示:对照组细胞融合率为1.29%±0.05%,明显高于siRNA干扰组(0.94%±0.15%),两者具有显著的统计学差异(P<0.05)。结论:TMVs正向调控HUVEC中VCAM-1的表达,从而影响CAL-27与HUVEC细胞融合。第三部分微囊泡内miR-146a-5p对CAL-27/HUVEC融合的作用研究目的:探讨常氧和低氧刺激下CAL-27来源的微囊泡(TMVs)在促进CAL-27与HUVEC细胞融合的潜在分子机制,重点关注微囊泡的内容物miR-146a-5p对CAL-27与HUVEC细胞融合的影响。方法:通过实时定量逆转录PCR技术(quantitative Real-time RT-PCR)检测HUVEC、CAL-27、TMVs 内含有 miR-146a-5p 的表达。通过对 HUVEC 转染 miR-146a-5p mimics和inhibitor,观察CAL-27和实验组与对照组HUVEC的融合率的差别。并通过RT-PCR检测常氧和低氧状态下CAL-27释放的TMVs的miR-146a-5p的变化,以及这种改变对细胞融合的影响。并将miR-146a-5p转染入CAL-27,提取转染后的TMVs,检验TMVs内miR-146a-5p的含量,对比单纯的TMVs和转染后TMVs后对融合的影响。结果:1.RT-PCR结果显示:CAL-27内含有miR-146a-5p的表达。且相对HIOEC、口腔角质化细胞(OKC)、HGF和HUVEC,CAL-27表达量较高。2.RT-PCR 结果显示:miR-146a-5p mimics 和 inhibitor 转染入 HUVEC 的效率较高。3.相较对照组的HUVEC,转染mimics和inhibitor的HUVEC和CAL-27的融合情况发生了明显改变。转染miR-146a-5p mimics的HUVEC的融合率人工计数融合细胞和FACS检测的细胞融合率明显提高了,而转染入miR-146a-5p inhibitor的HUVEC的融合率人工计数法和FACS统计明显降低了。4.低氧促进CAL-27表达miR-146a-5p,能促进HUVEC和CAL-27的融合。并且低氧处理后提取的TMVs所含miR-146a-5p量也增加。低氧处理后提取的TMVs能促进二者的融合。5.Mimics 和 inhibitor 转染入 CAL-27 后,提取的 TMVs 中的 miR-146a-5p 的表达也发生了明显改变。TMVs(NC、mimics、inhibitor)刺激HUVEC后,人工计数法和FACS统计融合率也有显著性差异。结论:miR-146a-5p能够介导CAL-27与HUVEC细胞融合。肿瘤细胞表达的miR-146a-5p能够通过TMVs传递至HUVEC,增强HUVEC与CAL-27的融合能力。低氧可以促进CAL-27表达miR-146a-5p并能通过载体TMVs调控二者融合。综上所述,我们可以得知,在肿瘤微环境中,低氧和微囊泡能促进细胞融合,在融合过程,低氧、EMT、促融合蛋白VCAM-1和TMVs均在融合过程起到了重要作用;低氧一方面可以促进HIOEC发生EMT,从而促进其与CAL-27发生融合。另一方面,低氧能增加TMVs内miR-146a-5p的表达来影响CAL-27/HUVEC细胞融合。以上均是低氧促进细胞融合的机制。