目前,肽和蛋白质在液-固界面上的色谱保留机理研究仍然是生物医学、生物工程相关的分离科学领域的前沿和热点课题。反相液相色谱已被广泛应用于蛋白质组学研究、治疗肽的分离分析中。但是,在肽的分析中,重叠峰的出现、色谱峰不规律问题还一直没有得到解决。传统分离纯化蛋白质中通常采取先沉淀,随后再进行液相色谱分离的方法,存在耗时较长,回收率较低。在所有的一维、二维液相色谱分离中,都需要提高选择性,寻找差异性,最大化的提高分离空间。不同于小分子化合物,多肽和蛋白具有三维空间结构,它们在色谱中的保留行为差别很大。本论文较系统地研究了液-固界面上6种三肽、2种寡肽和4种多肽在反相液相色谱上的“停滞-迁移”双保留行为和双保留机理。进一步探讨了蛋白质在疏水相互作用色谱中的保留行为和热力学性质。这些研究对实际应用中靶向肽和蛋白质药物的工业化生产也具有实际应用价值。本文主要研究了肽和蛋白质在色谱中的双保留机理,主要内容如下:1.文献综述。通过引用156篇文献,对液相色谱分离肽和蛋白质的研究进展、液相色谱中溶质的保留模型、保留模型与保留行为的关系以及计量置换理论模型与应用做了介绍和综述。2.反相液相色谱梯度洗脱下肽的停滞-迁移双保留特征。采用非同步进样的实验方法,对6种三肽、2种寡肽和4种多肽在反相液相色谱梯度洗脱中的保留时间和进样时间用二次回归分析,建立了预测肽保留的方法,计算停滞迁移点。并应用计量置换理论的研究方法,通过测定RPLC中的第一组线性参数Z和logI值,第二组线性参数j和logφ,以表征不同肽和固定相间的相互作用。发现6种三肽、2种寡肽和4种多肽的保留受“停滞区域”和“迁移区域”两个变量所控制,其中停滞区域对溶质的保留贡献较大。3.反相液相色谱梯度洗脱下肽的局部调整保留动态分离方法。局部调整保留动态分离方法,是一种同时快速识别和提高重叠峰选择性的新方法。通过6种肽混合物作为研究对象,在梯度洗脱作用下通过改变流动相流速,稳定部分肽的洗脱次序,快速地识别肽分离中所出现的重叠峰。并用胰蛋白酶酶解的溶菌酶样品对所建立的方法进行测试,得到了满意的分离结果。由流速改变引起的肽保留的变化,主要是由停滞区域的肽分子与固定相间相互作用强弱,和迁移区域流动相与固定相的能量传递引起的。该方法有望应用于肽类药物的质量控制、肽图谱建立、蛋白质组学以及肽类产品的分离纯化研究。4.疏水相互作用色谱中蛋白质的停滞-迁移保留特征。在梯度洗脱模式下,完整蛋白质在疏水色谱中的保留受两个变量的控制,也由停滞区域和迁移区域两部分组成。以5-6种蛋白质为研究对象,用非同步进样的实验方法,根据蛋白在梯度洗脱过程中的保留特性,对6种蛋白保留时间和进样时间进行一元二次数学拟合,计算出停滞迁移点,探讨疏水色谱中蛋白质停滞-迁移保留机理。同时依据计量置换理论的方法,研究了温度对保留的影响,计算Z和logI以及蛋白质在整个洗脱过程的自由能变化,解释“停滞-迁移”的可能保留规律。基于建立的SR/MR的优化策略,用在线单柱二维色谱在40 min内分离纯化工业淀粉酶,实现目标蛋白的快速分离,质量回收率可达到91.5%。5.疏水相互作用色谱中蛋白质保留的热力学行为。在疏水相互作用色谱中,分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃条件下,用非线性Van’t Hoff作图求得5种蛋白质的热力学参数(ΔH^?、ΔS^?、ΔC_p^?、ΔG^?),研究疏水色谱中蛋白质保留的热力学行为。并依据计量置换的研究方法,测定了五种蛋白质的第一组线性参数logI和Z值,第二组线性参数j和logφ,从热力学角度表征不同蛋白质和固定相间的相互作用,解释停滞-迁移可能的保留机理。疏水模式下,蛋白质的保留过程是吸热混乱度增大的过程。焓驱动下,形成分子间作用力使蛋白稳定。而熵驱动下,促进蛋白解离。