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目的： 通过观察缺氧环境下抗血管生成药物贝伐单抗(bevacizumab,Bev)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖能力、成管能力、迁移能力的作用,揭示其对内皮细胞标志物蛋白水平的影响,初步探讨缺氧及此环境下高剂量贝伐单抗引起HUVEC生物学行为改变的可能原因. 方法： 选取细胞生长状况良好,细胞形态正常HUVEC细胞(即HUVEC生长至70%-80%密度),根据前期实验结果选择后续实验中贝伐单抗浓度为80μg/ml、160μg/ml,为简化westernblots实验,高浓度贝伐单抗组采用100μ/ml浓度,并根据细胞形态及MTT结果,选择后续探索性实验的最佳观察时间点为药物作用后24h.Billups-rothenber研究装置建立体外缺氧模型,给乏氧箱充混合气(95%N2,5%CO2),通过氧浓度检测设备检测氧含量,乏氧环境：1%O2+5%CO2+94%N2;利用MTT法检测缺氧环境下贝伐单抗对HUVEC细胞增殖能力的影响;利用Transwell迁移实验检测缺氧环境下贝伐单抗对HUVEC迁移能力的影响;利用成管实验检测缺氧环境下贝伐单抗对HUVEC成管能力的影响;利用400μl Matrigel包埋HUVECs细胞、VEGFA及不同剂量药物浓度(0,10,100μg/ml)的贝伐单抗,皮下注射于5-8周龄的BALB/c-nu小鼠,并同时每2周给小鼠腹腔注射贝伐单抗(0,5,50mg/kg)以保证贝伐单抗药物浓度,作用30天,处死小鼠,取小鼠基质胶给予固定,并行HE染色和免疫组化染色,模拟体内高浓度贝伐单抗对HUVECs细胞体内成管的作用. 利用Western blot检测缺氧环境下贝伐单抗对HUVEC内皮因子(endoglin/CD105)及其下游EMT及炎性因子的蛋白水平变化,EMT指标：平滑肌激动蛋白(α-SMA)、N-cadherin、twist、slug,炎性因子IL1B、CCL20蛋白水平的变化;利用免疫荧光法及免疫组化方法验证高浓度贝伐单抗对CD105的表达的变化情况.同时使用ELISA检测高浓度贝伐单抗作用于HUVECs细胞上清中转化生长因子β1(transforming growth factor-β,TGF-β)和VEGFA变化;同时检测HUVECs贝伐单抗及乏氧刺激后smad1,smad5,pSmad1/5的蛋白表达变化,利用RT-qPCR法检测CD105、alk1、smad1、smad5的mRNA水平的变化;为除外IgG1的因素导致CD105的上调,同时应用同型IgG1对照刺激HUVECs内皮细胞;同时检测乏氧环境下贝伐单抗对HIF-α的蛋白表达影响;利用c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)抑制剂及JNK siRNA探索CD105上调的上游机制,应用CD105的siRNA敲低CD105来观察CD105的下游EMT及炎性信号因子的改变. 并在小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3细胞(Immortalized mouse brain endothelial cell lines,bEND.3)及小鼠视网膜微血管内皮细胞(Mouse retinal microvascular endothelial cells,MRMEC)中进行验证CD105的变化及其上调机制. 结果： 1.MTT法检测结果：但是乏氧环境下高浓度贝伐单抗促进细胞增殖,低浓度贝伐单抗抑制HUVECs增殖. 2.Transwell迁移实验结果：单纯乏氧刺激不能刺激HUVECs迁移数量增加,差异无统计学意义;常氧条件下,给予高浓度贝伐单抗刺激,高浓度(80μg/ml)贝伐单抗组细胞的迁移数明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);而乏氧环境下给予高浓度贝伐单抗刺激时,Bev80μg/ml及160μg/ml相对于control组,HUVEC的迁移细胞数明显增加(P<0.01,<0.01). 3.HUVECs体外成管结果：乏氧环境下,高浓度贝伐单抗促进HUVECs成管增强,与对照组相比,高浓度贝伐单抗显著增加血管分支的长度,差异有统计学意义(P<0.001). 4.HUVECs体内血管形成结果：包裹高浓度贝伐单抗组的基质胶内HUVECs血管形成能力与对照组相比明显增强,且HE染色显示,高浓度贝伐单抗形成的管状结构不连续、畸形、相对分散;而给予低浓度贝伐单抗刺激时,形成的管状结构连续、成环状,形成的结构类似肿瘤"截获"的血管. 5.乏氧环境下高浓度贝伐单抗促进HUVECs细胞的CD105蛋白、mRNA表达增强,差异有统计学意义;同时免疫荧光结果显示,高浓度贝伐单抗显著增强CD105的表达量,差异有统计学意义;基质胶免疫组化的结果显示,高浓度贝伐单抗可以显著增强CD105的表达量,差异有统计学意义.同时,使用同型IgG1验证高浓度贝伐单抗可以上调CD105的表达,而IgG1不能上调其表达;乏氧环境下HIF-α的表达不受贝伐单抗药物浓度的影响. 6.乏氧环境下高浓度贝伐单抗可以促进HUVECs CD105下游EMT及炎性因子的蛋白表达增高,差异有统计学意义,高浓度组贝伐单抗相对于对照组,slug、twist、α-SMA、N-cadherin的表达量明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);而炎性因子如CCL20,IL1B蛋白表达量,高浓度贝伐单抗组与对照组相比,也显著上调,差异有统计学意义(P<0.001). 7.高浓度贝伐单抗激活TGFβ1信号通路,给予高浓度贝伐单抗刺激后,HUVECs内皮细胞中smad1,smad5,pSmad1/5的蛋白表达量明显增高,同时RT-qPCR结果验证,smad5,ALK1的表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);同时,ELISA验证细胞上清中TGFβ1的表达量,结果示高浓度贝伐单抗促进HUVECs细胞中TGFβ1的含量明显增加,差异有统计学意义.综合ELISA、westernblot、RT-qPCR结果,可知高浓度贝伐单抗激活TGFβ1信号通路 8.高浓度贝伐单抗激活JNK信号通路,乏氧环境下高浓度贝伐单抗上调pJNK及JNK的蛋白表达量,当用JNK siRNA或抑制剂下调JNK的表达后,贝伐单抗诱导的CD105的上调消失,说明CD105的上调由JNK信号通路介导. 9.乏氧条件下高浓度贝伐单抗可以上调小鼠视网膜微血管内皮细胞MRMEC及小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3的CD105上调,同时激活smad信号通路及JNK信号通路,阻断JNK信号通路后,贝伐单抗诱导的CD105上调被阻断,说明在小鼠微血管内皮细胞中,CD105的上调受JNK信号通路的介导. 10.使用CD105siRNA转染HUVECs细胞后,Western blot结果显示CD105下游EMT及炎性因子均显著下调,同时,给予CD105siRNA转染细胞后,与SiCON相比,细胞的迁移能力及增殖能力明显下调. 结论： 1.乏氧环境下,高浓度贝伐单抗可以增加内皮细胞的迁移、增殖、成管能力(体内体外),单纯乏氧环境或高浓度贝伐单抗均不能激活内皮细胞. 2.内皮细胞的活化是通过激活TGFβ1信号通路和JNK通路来上调CD105的表达,CD105及CD105下游的炎性因子及EMT相关因子可导致内皮细胞的迁移、增殖、成管能力增强.敲低CD105后,HUVECs细胞的迁移、增殖能力减弱. 3.CD105的上调可由JNK信号通路介导,贝伐单抗促进内皮细胞的活化与HIF-α,VEGFA等经典通路无关. 4.下调TGFβ1及JNK信号通路可能逆转贝伐单抗耐药,但贝伐单抗是通过与JNK直接作用还是通过TGFβ1间接上调JNK仍需进一步研究.