论文部分内容阅读
白细胞介素－2（IL-2）最初曾为称为T细胞生长因子，并能促使各种造血细胞增殖和分化。临床研究表明其关键作用可作为T淋巴细胞激活的增殖信号，因而将IL-2用于治疗艾滋病。基于其能刺激具有细胞毒的，抗肿瘤细胞的能力，IL-2还用于各种癌症的治疗。目前人IL-2已经完全用基因工程的方法生产，而且基因工程IL-2与天然IL-2的功能和临床效果基本一致。目的：近年来，虽然基因工程IL-2应用于肝炎及某些癌症的治疗已取得令人属目的成果，但大计量，长时间用药对病人仍然存在一定的副作用，如发热、寒战、恶心、呕吐、头晕、乏力和毛细血管渗漏综合症等，所以，为了提高人重组白细胞介素－2的稳定性和活性以及减少毒副作用，有必要定向改造rhIL－2的分子结构，并在毕赤酵母中高效表达hIL-2cDNA，获得hIL-2蛋白，拟对野生型hIL-2进行结构改造以获得新的突变体，同时进行活性测定，以便深入了解hIL-2的结构与功能的关系。方法：用PCR法从白细胞介素-2cDNA全序列中扩增成熟的肽基因片段，并利用定点突变技术将人重组白细胞介素－2第125位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列；编码18位亮氨酸的序列突变为蛋氨酸序列；编码19位亮氨酸的序列突变为丝氨酸序列，经限制酶片段分析与DNA序列分析证明后，获得突变体MvhIL-2。IL-2基因片段与酵母中间载体pPIC9K融合后，转化到大肠杆菌TOP10F’,扩增质粒，获得大量pPIC9K-MvhIL-2DNA后，再转化毕赤酵母，并在摇瓶和发酵罐上对IL-2-C125A/L18M/L19S进行了表达。然后，利用离子交换层析的方法纯化了MvhIL-2蛋白，利用IL-2依赖细胞株CTLL－2细胞对纯化的突变蛋白（IL-2-C125A/L18M/L19S）和野生型IL-2（同样方法获得的）进行测活。结果：本实验成功地构建IL-2突变体，并在毕赤酵母中得到表达。将pPIC9K-MvhIL-2DNA用酶切后，转入真核表达系统－毕赤酵母得到的转化子经摇瓶和发酵罐发酵，上清液用15％SDS-PAGE检测表明有IL-2突变体的表达；经Western-blot和ELISA检测有免疫活性。经超滤浓缩，强阴离子交换Q柱层析得到纯化的突变型人IL-2。纯化的突变蛋白对CTLL-2细胞有刺激性；与野生型IL-2相比，在各种温度条件下储存的突变蛋白保留有更高的活性；pPIC9KMvhIL-2整合到毕赤酵母中表达量占菌体总蛋白的30％以上，高表达得到的IL-2具有高活性。结论人IL-2cDNA可通过PCR技术进行定点突变，所获得的突变型MvhIL-2活性比天然型MvhIL-2高4－5倍。所以IL-2突变体（IL-2-C125A/L18M/L18S）较野<WP=5>生型的IL-2具有更高的稳定性和活性。