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猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronaviruses,PDCo V)是一种新流行的冠状病毒,目前PDCo V的检测方法较少。Ns6是PDCo V的特殊辅助蛋白,据报道,许多辅助蛋白参与体内的免疫调节和影响病毒的发病机制。本研究对PDCo V四川株的Ns6基因进行克隆和生物信息学分析,以原核表达的Ns6蛋白为抗原建立间接ELISA抗体检测方法并进行了临床样品检测评价。1.PDCo V的Ns6基因克隆及生物信息学分析参照NCBI公布的PDCo V的Ns6基因序列设计引物,用RT-PCR扩增四川株PDCo V-SC2015的Ns6基因,构建了Ns6基因克隆质粒,基因测序和变异分析。结果显示Ns6基因全长285 bp,与CH/Sichuan/S27/2012的Ns6基因同源性达99%;将扩增所得的PDCo V Ns6基因命名为CHN-SC2015株Ns6基因,该片段与CH/Sichuan/S27/201株相比变异发生在碱基的突变;经过遗传进化分析,绘制系统发育树显示CHN-SC2015毒株Ns6基因与目前中国大陆分离的PDCo V毒株的Ns6基因的进化距离较近,其中与CH/Sichuan/S27/2012株和HKU15/S579、CH/SXD1/2015CHN-LYG-2014亲缘关系最近,与美国及韩国毒株进化关系较远;对CHN-SC2015毒株Ns6蛋白氨基酸序列进行预测显示该蛋白为不稳定不具有糖基化位点的亲水蛋白,二级结构预测显示存在有丰富的α螺旋,是一个非跨膜蛋白。2.PDCo V Ns6蛋白的原核表达与兔多克隆抗体制备以p ET-32a(+)载体对Ns6蛋白进行重组表达,经SDS-PAGE电泳鉴定表达的重组蛋白大小约为32 k Da;重组蛋白的最佳诱导条件为30℃、终浓度为0.6 m M的IPTG诱导携带重组质粒的Transseta菌株表达5 h;重组蛋白在上清中表达,以Ni+亲和层析法纯化对上清中的重组蛋白,经SDS-PAGE电泳鉴定,获得了浓度为1.2 mg/m L的重组蛋白。将纯化的Ns6蛋白与弗氏佐剂混合免疫新西兰兔三次,ELISA检测免疫血清效价达到1:128000。本研究制备的兔抗Ns6蛋白多克隆抗体用于PDCo V Ns6蛋白的研究。3.PDCo V Ns6蛋白间接ELISA检测方法的建立将纯化Ns6蛋白作为抗原以每孔100?g/m L置于37℃包被2h,5%BSA封闭90min,一抗血清1:100稀释,37℃孵育30min,酶标二抗1:5000稀释,37℃孵育60min,建立检测PDCo V抗体的间接ELISA检测方法(r PDCo V-Ns6-ELISA)。阴阳性临界值为0.431,灵敏性可达1:6400,有良好特异性,与其他5种常见的猪病(猪流行性腹泻、住传染性胃肠炎、猪瘟、猪繁殖障碍综合症、猪伪狂犬)无交叉反应,批内重复和批间重复实验的变异系数均小于10%。用Ns6-ELISA检测四川地区采集的387份血清进行检测,阳性率为0.52%。本研究建立的Ns6-ELISA具备良好的敏感性和特异性,为PDCo V的抗体检测和疫病普查提供了一种快速、简便的血清学方法。