多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P. multocida）能够引起多种动物感染，导致急性、败血性传染病，包括禽霍乱、牛出血性败血症、猪肺炎和猪萎缩性鼻炎、兔出血性败血症。多杀性巴氏杆菌属于革兰氏阴性菌，巴氏杆菌科巴氏杆菌属，主要以荚膜抗原和菌体抗原区分血清型，荚膜抗原有5群，分别为A、B、D、E、F群；菌体抗原分为16个型，分别为1、2、3、4、5、、16。本菌呈世界性分布，已给养殖业造成巨大的经济损失，是重点防控的疫病之一。本研究以兔源多杀性巴氏杆菌C51-17菌株为研究对象，采用选择性捕获转录序列技术对C51-17菌株分别在感染兔肝脏组织和BHI培养基培养的条件下的差异表达基因进行筛选。结果表明：通过选择性捕获转录序列技术鉴定到31个基因，按照其编码蛋白的功能分为5大类：新陈代谢和应激蛋白，细胞表面蛋白，调节蛋白、转运蛋白和3个未知功能蛋白。利用Real-timeRT-PCR对差异表达基因进行转录水平的验证，结果表明：purF、lon、dnaB、ftsQ和glpT等5个的基因与BHI培养基中生长的C51-17菌株的基因转录水平相比，C51-17菌株在感染兔肝脏组织中5个基因的转录水平均上调，上调了1.61～13.55倍。将C51-17菌株热休克蛋白70基因（dnaK）克隆到原核表达载体pPro-EXHTb进行序列分析和原核表达，诱导表达重组DnaK蛋白，进行抗原性和免疫原性分析，测定其生物学活性。结果表明：C51-17菌株的dnaK基因与其他多杀性巴氏杆菌菌株dnaK基因在核苷酸水平的同源性均在99.2%以上，与其他种属的细菌的dnaK基因的同源性在82.3%～97.5%；成功表达了C51-17菌株重组DnaK蛋白，分子量为70kDa，与预期大小一致，以可溶性的形式存在；Western blot试验证明，重组DnaK蛋白具有良好的抗原性；纯化的DnaK蛋白分别按照50μg/只和150μg/只免疫ICR小鼠，对致死性剂量的C51-17菌株的保护性分别为1/5和2/5；重组DnaK蛋白具有粘附细胞活性，并能抑制多杀性巴氏杆菌对细胞的粘附作用；将dnaK基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1构建真核表达质粒转染细胞，检测蛋白在细胞中的定位，结果表明：DnaK蛋白主要定位于细胞的细胞质中。采用正向筛选同源重组技术构建C51-17菌株ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株，利用PCR对突变株进行鉴定，分析其遗传稳定性、生长特性和致病性。结果表明：成功构建了多杀性巴氏杆菌ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株，连续传代20代，它们遗传稳定；ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株与亲本菌的体外生长曲线表明，ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株与亲本菌C51-17的体外生长曲线基本一致。ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株对ICR小鼠的致病实验结果表明：腹腔注射ICR小鼠，ΔdnaK突变株在剂量为1.0×10~2CFU时对小鼠有致死性，而ΔaroA突变株在剂量为1.0×10~6CFU时对小鼠无致死性；而亲本菌C51-17在剂量为1.0×10~2CFU对小鼠是完全致死性的。ΔdnaK突变株对小鼠的致病性无明显减弱，ΔaroA突变株对小鼠的致病性是减弱的。本研究采用选择性捕获转录序列技术筛选C51-17菌株在感染兔肝脏中和BHI培养的条件下的差异表达基因，利用Real-time RT-PCR对差异表达基因进行转录水平的验证。同时，采用正向筛选同源重组技术构建C51-17ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株。多杀性巴氏杆菌正向筛选同源重组构建突变株的技术与选择捕获转录序列技术鉴定到的多杀性巴氏杆菌兔体内差异表达基因相结合，为进一步研究多杀性巴氏杆菌致病机理和减毒新型基因工程疫苗奠定基础。