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第一部分：Racl在软骨细胞肥大钙化及骨关节炎病理中的作用研究目前一种普遍认同的理论认为,在骨关节炎(Osteoarthritis, OA)的发生过程中,关节表面软骨细胞发生了类似于软骨发育中的软骨内成骨(Endochondral Ossification)过程,导致了软骨细胞的病理性肥大、钙化(Hypertrophy and Calcification),最后导致软骨层遭到破坏。Racl (ras-Related C3 Botulinum Toxin Substrate 1)是鸟苷三磷酸酶(guanosine triposphatase, GTP)家族中的重要成员,具有Rho类型的GTP酶结合区,与GTP和二磷酸鸟嘌呤核苷(guanosine diphosphate, GDP)有高度亲和性,与GDP结合时失活,与GTP结合时激活。在C57小鼠的软骨中特异性敲除Rac1,会导致软骨内成骨过程受阻,肢体发育变短；体外软骨细胞中,Rac1的过度表达会促进软骨细胞肥大标志COLX promoter的活性升高,提示Racl在软骨发育过程中有促进软骨细胞肥大、钙化的作用。然而,Rac1在软骨细胞的病理性肥大、钙化作用,以及骨关节炎疾病发展中作用的研究仍然较为缺乏。本研究首次检测了OA软骨样本及正常软骨样本中Rac1总表达量、活性的区别。我们首先发现,OA软骨中Racl活性异常升高,提示Racl可能参与OA疾病的发展。为了验证Racl在OA中的作用,我们通过前交叉韧带和半月板切除术(ACLT)构建了小鼠OA模型,同时构建了Racl过度激活和Racl失活两种病毒载体,体外包装病毒并浓缩,通过关节腔注射病毒浓缩液改变关节软骨局部Rac1活性。术后8周对软骨的组织学检测发现,Rac1活性升高显著促进软骨基质降解,促进基质降解酶MMP13、ADAMTS-5的分泌以及软骨肥大钙化标志COLX和Runx2的表达。反之,降低Racl的活性显著减缓OA的发生。体外的机制研究表明,Racl激活能够促进软骨细胞病理性的肥大、钙化,而这种作用是通过促进β-catenin核内转运介导的。第二部分：Racl上游调控因子RhoGAP---OCRL1在调控Racl活性及软骨钙化中的作用研究第一部分研究已经发现OA软骨细胞中Racl的活性异常升高,由于Rac1属于小G蛋白家族,其活性的高低受细胞内一些专门的上游调控因子调控。如鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor, GEF)能够提高小G蛋白活性,GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein, GAP)能够降低小G蛋白活性。因此,我们推测软骨中某些GEF的上调或者某些GAP的下调导致了Rac1的活性的异常升高。通过荧光定量PCR检测,我们比较了正常关节软骨组织和骨关节炎病变软骨组织中20个GEF基因和8个GAP基因的表达差异。结果显示,在这些组织中,20个GEF因子的表达没有显著性升高,而我们所检测的GAP蛋白中,OCRL1是唯一一个有显著性下降的GAP基因。体外软骨钙化模型中,当向软骨细胞中转入外源性OCRL1质粒后,通过碱性磷酸酶染色(ALP)及其灰度定量可以发现,IL1β、 TGFa和TNFa促进软骨细胞钙化的作用被明显抑制。相反的,当用小干扰RNA (siRNA)敲降OCRL1后,IL1β、TGFα和TNFa引起的软骨细胞的钙化作用会被加强。软骨细胞中过表达OCRL1能够阻断ILβ导致Rac1的过度激活。相反的,siRNA敲降OCRL1能够进一步提高软骨细胞中Rac1的活性。分段克隆OCRL1 RhoGAP domain和非RhoGAP domain分别过表达于软骨细胞中并检测对软骨细胞病理变化的影响,发现OCRL1对软骨细胞的Rac1活性调节是通过其上的RhoGAP domain起作用的。最后,我们研究了体内OCRL1在小鼠ACLT造成的OA疾病发展中的作用。GFP对照和OCRL1慢病毒包装后,经浓缩后关节腔内注射。术后6周,外源性的GFP和HA检测证实病毒成功感染小鼠关节表面软骨,同时Rac1的活性随着外源性OCRL1的转入显著降低。Safranin Orange组织学染色结果可以看到,GFP对照小鼠的关节表现出典型OA病理改变,如软骨基质染色变浅,软骨产生明显缺损。而OCRL1组小鼠的关节软骨保存较为完整,软骨基质染色颜色也较深,只有在胫骨平台靠近内侧半月板的部分软骨,表面有纤维状软骨出现。同时对比GFP组,OCRL1组关节软骨表达更少的MMP13、ADAMTS-5和COLX。第三部分：靶向Racl的骨关节炎治疗及骨软骨缺损修复研究最后,为了更好的靶向Rac1干预骨关节炎发展,该研究创新地运用壳聚糖微球包裹Racl小分子抑制剂NSC23766,在关节腔内进行缓释。我们分别在小鼠ACLT关节不稳定OA模型和大鼠关节软骨缺损修复两种动物模型中,检测了Rac1壳聚糖缓释微球的潜在治疗作用。小鼠OA术后4周、6周和8周的样本组织学检测表明,OA关节腔内注射包裹NSC23766微球可以显著降低软骨细胞中Racl活性,同时抑制软骨基质的降解。对OA的严重程度进行OARSI评分,发现NSC23766微球缓释组具有更低的OARSI评分,更少的ADAMTS-5和COLX表达。在ADSCs促进大鼠软骨缺损修复模型中,TGFβ联合NSC23766壳聚糖微球可促进ADSCs向软骨细胞分化,同时抑制其进一步肥大、钙化。