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木质纤维素是自然界广泛存在且廉价的可再生资源,其主要成分纤维索、半纤维素是潜在的燃料丁醇生产原料。自然界存在大量可降解纤维素的微生物,包括细菌、放线菌、真菌等。哈氏嗜纤维菌（Cytophaga hutchinsoni)属于嗜纤维菌属,是一种可快速降解结晶纤维素的细菌,因其对纤维素高效的降解能力、独特的降解机制以及运动特性等引起人们的普遍重视。美国能源部已完成对该菌全基因组序列的测定。目前对该菌的研究主要集中在纤维素降解机制与滑动特性等方面,而对其进行代谢改造直接用于生物燃料生产的报道较少。
传统的梭菌厌氧发酵仅能产生直链1-丁醇,并且产量也不够理想。利用代谢工程技术,通过对包括大肠杆菌在内的氨基酸生物合成途径进行改造,可以生产分子链含碳原子个数为3至5的多种醇类,其中具有良好特性的异丁醇收率较高。这一研究进展为进一步探索转化生物质资源生产各种高级醇奠定了基础。在代谢工程改造氨基酸合成途径形成异丁醇的策略中,亮氨酸合成途径的α-异丙基苹果酸合酶(α-IPMS)尤为重要。该酶由leuA基因编码,可催化氨基酸合成的中间产物α-酮异戊酸接受乙酰辅酶A的乙酰基形成α-异丙基苹果酸,再经α-异丙基苹果酸脱水酶、异丙基苹果酸脱氢酶的催化产生α-酮异己酸。这一酶系同样可催化α-酮丁酸生成α-酮戊酸。而α-酮戊酸可在α-酮酸脱羧酶(KDC)与醇脱氢酶(ADH)作用下进一步生成具有广阔应用前景的新型燃料--丁醇。
本研究的目的是通过研究C.hutchinsoniiα-异丙基苹果酸合酶的酶学性质,为以后在C.hutchinsonii中探索开展代谢工程改造奠定基础。根据公开的基因组序列注释信息,发现C.hutchinsonii中Leu ABCD（亮氨酸合成酶系）的编码基因形成一个操纵子。通过PCR扩增得到了C.hutchinsonii的leuA基因,并将此基因编码的α-IPMS蛋白在大肠杆菌中进行了异源表达。为了进行比较,将来源于E.coli的α-IPMS蛋白也进行了重组表达。通过对酶学动力学参数分析比较发现E.coliα-IPMS对两个底物的Km比C.hutchinsonii的α-IPMS都小,并且催化效率也是E.coliα-IPMS较高。在将C.hutchinsoniiα-IPMS蛋白同源模建得到的三级结构和己报道的M.tuberculosisα-IPMS蛋白三级结构进行比较的基础上,选择了3个关键位点氨基酸进行了基因突变并对突变体进行了重组表达与纯化。比较突变前后酶活性发现,三个突变体的比酶活相对突变前均大幅下降,显示这几个位点对酶催化活性的发挥具有重要作用。