蛋白质分子伴侣素是一类细胞维持蛋白质活性的重要生物大分子,以同质或杂多亚基蛋白质聚合体的形式存在于所有细胞当中,在细胞的应激反应如温度、酸碱、高盐、氧化等条件下发挥核心作用。产甲烷古菌Methanosarcina acetivorans是从海洋沉积物中分离出的一种产甲烷嗜温古细菌,在全球的碳循环过程中发挥着重要的作用。其分子伴侣素的亚基基因有六个,其中一个是一型分子伴侣素(MA0086),与细菌中的GroEL/ES类似;其余五个是二型分子伴侣素(MA4413、MA4386、MA0857、MA0631、MA1682)。本实验对分子伴侣素基因MA4386、MA0857、MA0086基因进行克隆、表达,并对分子伴侣素MA4386基因编码蛋白质进行纯化以及相关性能测定。MA4386基因来源于古菌,其编码蛋白质羧基端富含带电荷的赖氨酸,带有很强的正电荷,可以通过静电力与带有负电荷的其他蛋白质和核酸相互结合,具有较强的亲和力。来源于古菌的基因在大肠杆菌中表达会由于密码子稀有性的不同出现表达问题。大肠杆菌作为表达菌时,在诱导表达过程中,因为大肠杆菌中密码子使用频率与古菌密码子不同,所以将分子克隆转入大肠杆菌中表达效率会降低。为了解决这一问题,本实验选取大肠杆菌BL21(DE3)-RILP菌株,通过优化各种实验条件,例如更换了诱导使用的培养基,减少IPTG诱导剂浓度、缓冲液增加盐离子浓度等等。使用2×YT培养基作为诱导培养基,IPTG终浓度为0.1 m M,缓冲液中增200 m M NaCl溶液以及菌体破碎时添加ATP和核酸酶,提高了MA4386基因编码蛋白质可溶性表达在上清中的含量,由原来全部形成包涵体,优化条件后蛋白质大量可溶表达于上清。通过蛋白质层析纯化系统AKTA Pure将MA4386分子伴侣素编码蛋白质纯化出来,最后测定了MA4386基因编码蛋白质的ATP酶活性,10μL MA4386蛋白释放磷酸根离子含量为1.707 nmol,酶活力(比活)为205.66 U/mg,证明分子伴侣素MA4386基因编码的蛋白确实具有ATP酶活性,能行使正常功能。