T1脂肪酶是重要的工业用酶之一,在实际工业应用中经常会受到高温、高压、极端pH等条件的胁迫,导致酶的稳定性和催化活性大打折扣,即鲁棒性较差,最终造成生产损失率高、生产成本增加等问题。因此,对T1脂肪酶进行合理改造获得鲁棒性强的突变体脂肪酶以扩大该酶的应用价值显得尤为重要。针对极端条件下T1脂肪酶鲁棒性较差的现状,本研究在高压扰动条件下对盖子结构进行分子动力学模拟,通过FoldX计算自由能以及稳定性预测软件I-mutant 2.0、STRUM和DynaMut的联合预测对突变体进行筛选。再进一步通过实验验证获得了鲁棒性增强的T1脂肪酶突变体,使T1脂肪酶能更好地适应工业生产的需求。主要研究内容如下:（1）在不同压力下（1Bar,100Bar,500Bar,1000Bar,2000Bar,4000Bar）对T1脂肪酶进行分子动力学模拟,通过计算B-Factor、RMSD、RMSF和Rg值分析脂肪酶结构的变化趋势,确定与脂肪酶功能密切相关的关键区域为盖子结构域的a6螺旋。对该区域的氨基酸进行虚拟饱和突变,通过FoldX选择自由能变化小于0的突变体,构建突变体库。再使用I-mutant 2.0、STRUM和DynaMut对突变体库进行第二轮预测筛选,选择三个软件预测结果的交集作为后续的研究对象,最终得到8个突变体:A190L、A186L、L188M、A190Y、Q184I、Q184L、Q184M和V187M;（2）对突变体进行酶活和稳定性表征,结果显示突变体L188M、A190Y、A190L和A186L的T_m值相比野生型分别提高4.94℃、2.04℃、4.35℃和3.64℃,k_cat/K_m提高45.8%-73.1%。V187M酶活和稳定性呈小幅度提高趋势,T_m值上升1.43℃,k_cat/K_m提高16.6%,但是Q184I、Q184L和Q184M酶活和稳定性均呈下降趋势。对酶活和稳定性均提升的四个突变体的最适pH、pH稳定性、有机溶剂耐受性、金属离子耐受性及底物选择性作进一步探究,结果表明单点突变体整体的鲁棒性得到提升;（3）将单点突变体A186L、A190L、L188M、A190Y进行组合,得到4个复合突变体:A186L/A190L、A186L/A190Y、L188M/A190L和L188M/A190Y,酶学性质表征结果显示复合突变体L188M/A190L和L188M/A190Y的最适温度提高5℃,T_m值相比野生型分别提高5.43和5.47℃。相比单点突变体,两个复合突变体k_cat/K_m提高效果更明显,有机溶剂耐受性增强,对金属离子Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺耐受性约为野生型的两倍,酶整体的鲁棒性相比单点突变体具有更明显的改善。