目的:慢性持续性疼痛作为一种对经济、社会产生重大影响的疾病,一直备受关注。长久以来慢性疼痛给患者带来的不仅是难以忍受的疼痛感受,更为严重的是还会产生影响人们身心健康的负性情绪。与痛感受相比,介导痛情绪的神经传导通路及其产生的中枢机制大为不同。许多临床前研究都表明大脑额叶内侧的前扣带皮层(anterior cingulate cortex,ACC)参与处理痛情绪,ACC尤其是其吻侧部(rostral ACC,rACC)接收来自于内侧丘脑以及皮层区域的痛信号输入,参与了与疼痛相关的负性情绪的形成和调节。动物行为学、电生理学等相关实验研究也表明,前扣带皮层主要参与情感功能,在痛情绪的处理中起重要作用。有实验观察到化学损毁ACC的头端,可抑制福尔马林引起的条件性位置回避反应(conditioned place avoidance,CPA)。已知ACC脑区内主要有三类阿片受体:μ-、δ-和κ-阿片受体。我们的前期研究已经证实,激活rACC脑区神经元μ-、δ-阿片受体可以下调rACC脑区NMDA受体的磷酸化水平,抑制由完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)诱导rACC神经元放电频率的增高,反转C-CPA反应从而缓解痛情绪,但激活κ-阿片受体是否有类似的作用并不清楚,因此本课题就此进行深入探讨。本实验拟以大鼠脚掌注射CFA诱导的条件性位置回避(C-CPA)模型作为痛情绪的测量指标,并在rACC脑区内分别微量注射不同浓度κ-阿片受体激动剂Dynorphin A,采用行为学、在体多通道电生理记录技术、蛋白印记技术探讨此实验中激活rACC脑区内κ-阿片受体是否可以缓解痛情绪反应。方法:1.建立炎性疼痛模型本实验选取成年雄性SD(Sprague Dawley)大鼠,体重250-270g,左侧后脚掌皮下注射0.08ml完全弗氏佐剂(CFA),建立炎症性疼痛模型。左侧后脚掌皮下注射0.08ml生理盐水(NS)组和足底未注射组作为对照。2.建立C-CPA模型将大鼠随机分为3组:(1)脚掌未注射组;(2)脚掌注射生理盐水(NS)组;(3)脚掌注射CFA实验组;每组6-8只。大鼠通过左侧脚掌皮下注射CFA引起慢性炎症性疼痛,并与可识别和记忆的的环境耦合,建立条件性位置回避(C-CPA)模型,大鼠在痛环境适应前后比较在痛侧停留的时间,并计算回避分数(CPA Score),以此来观察大鼠是否产生了条件性位置回避反应。3.检测热缩足潜伏期(Paw Withdrawal Latency,PWL)在左侧脚掌注射CFA的前一天和第二天分别检测各组大鼠的PWL,观察注射CFA以及rACC注射不同浓度的Dynorphin A后大鼠热痛行为的变化。4.利用在体多通道电生理技术记录、处理、分析rACC脑区神经元的放电活动。5.通过western-blot检测κ-阿片受体和NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平在所有行为实验完成之后,取大鼠rACC脑区组织,通过western-blot技术检测各组大鼠rACC脑区内κ-阿片受体和NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平。6.实验分组根据左侧脚掌皮下注射CFA/NS,rACC脑区分别注射不同浓度的Dynorphin A/NS,将大鼠分为以下12组。12组动物(n=6-8只/组)=2(CFA、NS)×6(五个浓度的κ阿片受体激动剂、NS)结果:1.大鼠rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂Dynorphin A可以抑制CFA引起的条件性位置回避反应(1)给大鼠左后脚掌皮下注射CFA后,大鼠对热的缩足潜伏期(PWL)明显减少,痛模型成功建立。大鼠左侧后脚掌未注射组、注射NS组、CFA组比较,注射CFA组大鼠PWL第三天与第一天的baseline值相比明显减小,有统计学差异(P<0.05);注射NS组和未注射组的PWL第三天与第一天的baseline值相比均无差异(P>0.05)。以上表明给脚掌皮下注射CFA诱导了大鼠的炎性疼痛。(2)CFA皮下注射于大鼠的左侧后脚掌,使得大鼠产生条件性位置回避反应脚掌注射CFA组,大鼠痛环境匹配前后第三天在痛侧停留的时间明显小于第一天(P<0.05),说明对环境产生厌恶反应。脚掌未注射组和脚掌注射NS组,大鼠痛环境匹配前后第三天在痛侧停留的时间和第一天相比都没有显著性差异(P>0.05),两组回避分数间没有差别(P>0.05),结果显示CFA注射于后脚掌使大鼠产生了CPA发应。(3)在rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂Dynorphin A可以抑制CFA引起的条件性位置回避反应在左侧脚掌皮下注射NS,rACC内注射κ-阿片受体激动剂Dynorphin A或NS,即NS+κ-阿片受体激动剂组和NS+NS组,这两组大鼠在脚掌和rACC注射后分别在驻留环境(痛环境)条件化适应,在环境适应后第二天(实验第三天)大鼠在痛侧环境停留的时间与第一天相比都没有统计学差异(P>0.05),且两组的回避分数之间也无统计学意义(P>0.05),说明Dynorphin A本身不会影响大鼠的CPA反应。在左侧脚掌皮下注射CFA,rACC内分别注射0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL、5μg/μL、10μg/μL的κ-阿片受体激动剂Dynorphin A或NS。各组大鼠脚掌注射CFA并与痛环境匹配后,5μg/μL和10μg/μL的Dynorphin A给药组大鼠第三天在痛侧停留的时间与第一天相比均无统计学差异(P>0.05),而在rACC分别给予NS、0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL Dynorphin A的大鼠第三天在痛侧停留时间均小于第一天,差异具有统计学意义(P<0.05)。回避分数:CFA+NS组与CFA+5μg/μL Dynorphin A回避分数具有统计学差异(P<0.05);CFA+NS组与CFA+10μg/μL Dynorphin A回避分数也具有统计学差异(P<0.05),而CFA+5μg/μL和CFA+10μg/μL Dynorphin A两组的回避分数之间无统计学差异(P>0.05),这表明在rACC脑区分别给予5μg/μL和10μg/μL的Dynorphin A可抑制大鼠的CPA反应。大鼠左侧足底注射CFA,rACC内分别注射0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL、5μg/μL、10μg/μL的Dynorphin A或NS,各组大鼠PWL值第三天与第一天比均减小,差异具有统计学意义(P<0.05),说明rACC内注射Dynorphin A不影响CFA引起的热痛敏感性的增加。2.大鼠rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂Dynorphin A可以抑制CFA引起的神经元放电频率的增加(1)CFA皮下注射于大鼠的左侧后脚掌后,rACC脑区神经元放电频率增加脚掌注射CFA组,条件匹配后第三天大鼠在痛环境和非痛环境rACC脑区神经元的放电频率相比,在痛环境的放电频率明显高于非痛环境,差异具有统计学意义(P<0.05);脚掌注射CFA组大鼠条件匹配后第三天痛侧的rACC脑区神经元放电频率与NS组、Na?ve组相比,放电频率都明显增加(P<0.05),表明CFA注射于大鼠后脚掌使rACC脑区神经元放电频率增加。(2)κ-阿片受体激动剂Dynorphin A本身不影响rACC脑区的放电活动左侧后脚掌皮下注射NS,rACC内注射κ-阿片受体激动剂Dynorphin A或NS,即NS+κ-阿片受体激动剂和NS+NS两组,这两组大鼠匹配后第三天痛侧的rACC脑区神经元放电频率分别与非痛侧相比,均无差异(P>0.05),且两组的痛侧放电频率相比也无差异(P>0.05),表明激动剂本身不影响rACC脑区的放电活动。(3)κ-阿片受体激动剂Dynorphin A可以抑制CFA引起的神经元放电频率的增加左侧脚掌皮下注射CFA,rACC内分别注射0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL、5μg/μL、10μg/μL的Dynorphin A或NS。CFA+5μg/μL Dynorphin A和CFA+10μg/μL Dynorphin A组大鼠在痛环境匹配后第三天在痛侧与非痛侧神经元放电频率相比,均无统计学差异(P>0.05),而CFA+NS、CFA+0.5μg/μL、1μg/μL、2.5μg/μL Dynorphin A组第三天在痛侧与非痛侧神经元放电频率相比,痛侧的放电频率明显高于非痛侧,差异具有统计学意义(P<0.05)。且CFA+5μg/μL和10μg/μL Dynorphin A组痛侧的放电频率与CFA+NS组相比,均明显降低(P<0.05)。电生理结果显示高浓度的5μg/μL和10μg/μL Dynorphin A两组抑制了CFA引起的放电频率的增加。3.大鼠rACC脑区注射κ-阿片受体激动剂Dynorphin A可以上调κ-阿片受体的表达水平,下调CFA引起的NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平的增加(1)CFA皮下注射于大鼠的左侧后脚掌使得rACC脑区NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、Glu N2B的磷酸化水平增加大鼠脚掌注射CFA或NS,rACC内给予NS,以及Na?ve组,这三组相比,CFA+NS组rACC内NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平显著升高,有统计学意义(P<0.05)。表明CFA注射于大鼠后脚掌可使rACC内GluN1、GluN2A、GluN2B亚基的磷酸化水平增高。(2)κ-阿片受体激动剂Dynorphin A可以上调κ-阿片受体的表达水平,下调CFA引起的NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平的增加大鼠脚掌注射CFA,rACC内注射不同浓度的κ-阿片受体激动剂Dynorphin A/NS,CFA+5μg/μL Dynorphin A组和CFA+10μg/μL Dynorphin A组与CFA+NS组相比,rACC脑区内κ-阿片受体表达水平显著增高,具有统计学意义(P<0.05),NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平降低,也具有统计学意义(P<0.05),但这两组之间无统计学差异(P>0.05)。其他浓度组与CFA+NS组相比κ-阿片受体表达水平和NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平均无差异(P>0.05)。说明高浓度的Dynorphin A可以上调κ-阿片受体的表达水平,同时下调CFA诱导的rACC内NMDA受体亚基GluN1、GluN2A、GluN2B的磷酸化水平的增加。结论:大鼠注射CFA后上调rACC脑区NMDA受体GluN1、GluN2A、Glu N2B亚基磷酸化水平,增加神经元的放电频率,从而引起大鼠的CPA反应,即产生了痛情绪反应,而在rACC脑区注射一定浓度的DynorphinA后,激活了κ-阿片受体,下调GluN1、GluN2A、GluN2B亚基磷酸化水平,抑制CFA引起的rACC脑区神经元放电频率的增加,从而缓解了这种痛情绪反应。