背景铁死亡是细胞内游离铁离子积累引起细胞氧化损伤而诱导的一种新的调节性细胞死亡方式。研究发现细胞铁死亡介导的氧化应激损伤参与了多种疾病的发病过程。炎症、氧化应激和脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）发病的主要病理诱导因素。细胞凋亡、坏死和自噬等多种调节性细胞死亡方式参与动脉粥样硬化发病过程。而且细胞死亡过程中释放的有害介质通过诱导氧化应激和炎症加重细胞和组织损伤。血管内皮功能紊乱是诱发动脉粥样硬化的重要病理机制。目前,关于铁死亡是否参与血管内皮细胞炎症损伤过程及其作用机制尚不明确。充分探究铁死亡对血管内皮细胞损伤的作用及调节机制,对指导动脉粥样硬化治疗、改善其愈后具有重要意义。NRF2是一种重要的抗氧化转录因子,通过调节多种抗氧化因子表达而起到氧化防御功能。此外,NRF2也是细胞铁死亡的负调节因子,能够通过激活谷胱甘肽转运系统提高细胞抗氧化防御能力、通过抑制铁蛋白降解降低细胞内游离铁水平、以及通过调节线粒体活性和脂质过氧化损伤调节多种铁死亡关键基因表达。同时,NRF2亦是重要的氧化稳态调节因子。目前,关于NRF2对血管内皮细胞铁死亡、炎症和细胞衰老的调节作用及具体调节机制,以及NRF2介导的氧化还原适应机制在氧化损伤诱导的血管内皮细胞铁死亡中的调节作用仍有待系统地研究。目的1.研究铁死亡在血管内皮细胞炎症损伤中的作用及其与血管内皮细胞炎症和细胞衰老的关系;2.探究NRF2对血管内皮细胞铁死亡、炎症损伤及衰老的调控作用及机制;3.阐明NRF2介导的氧化还原稳态调节机制对氧化应激导致的血管内皮细胞损伤和铁死亡的适应性调节作用;4.探讨铁死亡是否参与急性心肌梗死患者疾病发病过程。方法1.应用LPS处理HUVECs细胞,构建血管内皮细胞炎症损伤和衰老模型（1）用不同剂量（0μg/m L,0.5μg/m L,1μg/m L,2μg/m L,4μg/m L和8μg/m L）的LPS处理HUVECs细胞24 h,明确最佳药物作用浓度后,用2μg/m L LPS处理HUVECs不同时间（0 h,6 h,12 h,24 h和48 h）,CCK8法检测胞活力;（2）Western Blot检测2μg/m L LPS处理HUVECs不同时间（0 h,1 h,3 h,6 h,9 h,12 h和24 h）后血管内皮细胞炎症相关蛋白HMGB1、IL-6和TNF-α的表达;（3）β-半乳糖苷酶染色检测在不同浓度（0μg/m L,1μg/m L,2μg/m L,4μg/m L）LPS以及2μg/m L LPS处理HUVECs不同时间（0 h,12 h,24 h,48 h）后细胞衰老变化;Western Blot检测LPS对HUVECs内衰老蛋白p53、p21和p16表达的影响。2.探究铁死亡在LPS诱导的血管内皮细胞炎症损伤和衰老中的作用（1）2μg/m L LPS处理HUVECs不同时间（0 h,1 h,3 h,6 h,9 h,12 h和24h）,Calcein-AM探针和细胞铁检测试剂盒检测细胞内铁离子浓度,细胞微量还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）检测试剂盒检测细胞内GSH和MDA水平,DCFH-DA探针检测HUVECs内ROS水平,Mito Tracker标记细胞内线粒体,q RT-PCR和Western Blot检测铁死亡相关GPX4、x-CT、PTGS2、NCOA4和FTH m RNA和蛋白表达;（2）铁死亡抑制剂（Fer-1）预处理HUVECs细胞3 h,后予以2μg/m L LPS处理HUVECs,分别检测细胞内铁离子、GSH、MDA、ROS和线粒体损伤情况,以及细胞铁死亡相关GPX4、x-CT、PTGS2、NCOA4和FTH m RNA和蛋白表达,进一步证实铁死亡参与LPS诱导的HUVECs炎症损伤过程;（3）Western Blot检测Fer-1抑制铁死亡后LPS处理的HUVECs内HMGB1、IL-6和TNF-α炎症蛋白的表达;（4）β-半乳糖苷酶染色检测Fer-1预处理HUVECs后LPS对细胞衰老的影响,Western Blot检测Fer-1预处理HUVECs后LPS诱导的HUVECs内p53、p21和p16衰老蛋白表达变化。3.探究NRF2对血管内皮细胞铁死亡、炎症及衰老的调控作用及机制（1）Western Blot和q RT-PCR检测LPS处理的HUVECs在抑制铁死亡前后NRF2总蛋白、核蛋白、浆蛋白以及NRF2 m RNA表达情况,同时使用免疫荧光染色观察NRF2入核情况,验证抑制铁死亡前后LPS对NRF2核内移的影响;（2）通过NRF2过表达质粒和NRF2抑制剂ML385建立NRF2高表达和低表达模型,检测过表达和抑制NRF2后LPS对HUVECs的细胞活力、细胞内铁离子、GSH和MDA水平、线粒体形态和ROS水平以及铁死亡相关蛋白GPX4、x-CT、PTGS2、NCOA4和FTH表达影响,探讨NRF2对LPS诱导的HUVECs铁死亡的调控作用;（3）Western Blot检测过表达和抑制NRF2对LPS诱导的HUVECs炎症蛋白HMGB1、IL-6和TNF-α表达水平的影响;（4）β-半乳糖苷酶染色检测过表达和抑制NRF2对LPS诱导的HUVECs衰老的影响,Western Blot检测过表达和抑制NRF2后LPS诱导的HUVECs内衰老蛋白p53、p21和p16表达变化。4.探究NOX4/ROS/NRF2轴是否参与LPS诱导的HUVECs铁死亡和炎症损伤过程,及NRF2对血管内皮细胞NOX4过表达引起的氧化损伤和铁死亡的适应性调节作用（1）Western Blot检测LPS诱导的HUVECs在抑制铁死亡前后NOX4蛋白表达情况,验证NOX4是否参与LPS诱导的血管内皮细胞炎症损伤和铁死亡;（2）用NOX4过表达质粒构建NOX4高表达模型,检测过表达NOX4后LPS处理的HUVECs内ROS水平,线粒体形态、丰度以及铁死亡相关蛋白GPX4、x-CT、PTGS2和FTH表达情况,探究NOX4对细胞氧化损伤和铁死亡的影响;（3）Western Blot检测过表达NOX4后HUVECs内NRF2蛋白表达变化,用ROS生成抑制剂NAC（5 m M）处理NOX4过表达和LPS处理的HUVECs,检测抑制ROS生成后NRF2蛋白表达情况;（4）检测过表达NOX4的HUVECs在抑制NRF2后的细胞增殖活力和铁死亡相关蛋白GPX4、x-CT、PTGS2和FTH的表达,验证NRF2对NOX4诱导的血管内皮细胞氧化损伤和铁死亡的调节作用。5.探究铁死亡在急性心肌梗死发病过程中的作用（1）收集急性心肌梗死患者（疾病组）以及同期就诊的未发生过急性心肌梗死的冠心病患者（对照组）的一般病史资料,临床生化指标以及血清,血清铁离子、GSH和MDA检测试剂盒检测血清铁、GSH和MDA水平;（2）对比分析急性心肌梗死患者与对照组冠心病患者一般病史资料、临床生化检测指标以及血清铁离子、GSH和MDA水平,并行血清铁离子、血清MDA和血脂水平相关性分析。结果1.LPS诱导血管内皮细胞炎症损伤和衰老,构建了血管内皮细胞炎症损伤和衰老模型（1）LPS刺激HUVECs后,LPS时间和剂量依赖性地降低HUVECs细胞增殖活力;（2）LPS时间依赖性地上调HUVECs内炎症蛋白HMGB1、IL-6和TNF-α表达;（3）LPS剂量和时间依赖性地增加HUVECs中β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比率,且LPS时间依赖性地上调HUVECs内p53、p21和p16等衰老蛋白表达。2.铁死亡参与血管内皮细胞炎症损伤过程,抑制铁死亡减轻LPS诱导的血管内皮细胞炎症和衰老（1）铁死亡参与LPS诱导的HUVECs炎症损伤,LPS时间依赖性地上调HUVECs铁离子、MDA和ROS水平、诱导线粒体损伤、下调细胞GSH水平,且LPS下调HUVECs内抗铁死亡因子GPX4、x-CT和FTH m RNA和蛋白表达,上调促铁死亡因子PTGS2和NCOA4 m RNA和蛋白表达;（2）铁死亡抑制剂Fer-1上调LPS诱导的HUVECs增殖活力、降低LPS诱导的HUVECs内铁离子、MDA、ROS水平、减轻线粒体损伤、升高细胞GSH水平,分子水平提示Fer-1上调LPS诱导的HUVECs内抗铁死亡因子GPX4、x-CT和FTH m RNA和蛋白表达,下调促铁死亡因子PTGS2和NCOA4 m RNA和蛋白表达;（3）抑制铁死亡下调LPS诱导的HUVECs内HMGB1、IL-6和TNF-α炎症蛋白表达水平;（4）抑制铁死亡降低LPS诱导的HUVECsβ-半乳糖苷酶染色阳性细胞比率,下调LPS诱导的HUVECs内衰老相关蛋白p53和p21表达水平。3.血管内皮细胞炎症损伤过程伴随抗氧化防御因子NRF2激活,过表达NRF2减轻LPS诱导的血管内皮细胞铁死亡、炎症损伤和细胞衰老（1）LPS时间依赖性地上调HUVECs内NRF2 m RNA、总蛋白和核蛋白表达水平,免疫荧光检测结果提示LPS诱导NRF2入核增多;抑制铁死亡下调LPS诱导的HUVEC内NRF2总蛋白和核蛋白表达,减少NRF2核内转移;（2）过表达NRF2抵抗LPS诱导的HUVECs死亡、降低LPS诱导的HUVECs铁离子、MDA和ROS水平、减轻线粒体损伤、升高细胞GSH水平,上调抗体死亡因子x-CT、GPX4和FTH蛋白表达,下调促铁死亡因子PTGS2和NCOA4蛋白表达;抑制NRF2加剧LPS诱导的HUVECs细胞死亡、上调LPS诱导的HUVECs铁离子、MDA和ROS水平、加剧线粒体破坏、降低细胞内GSH水平,下调x-CT、GPX4、NCOA4蛋白表达,上调PTGS2和FTH蛋白表达;（3）过表达NRF2下调LPS诱导的HUVECs炎症蛋白HMGB1、IL-6和TNF-α表达;抑制NRF2上调LPS诱导的HUVECs内炎症蛋白HMGB1、IL-6和TNF-α表达;（4）过表达NRF2减少了LPS诱导的HUVECs中β-半乳糖苷酶染色阳性比率,降低了p53和p21衰老蛋白表达水平;抑制NRF2增加了LPS诱导的HUVECsβ-半乳糖苷酶染色阳性细胞比率,上调了p53和p21衰老蛋白表达水平。4.NOX4/ROS/NRF2调节轴参与LPS诱导的血管内皮细胞铁死亡,NRF2介导的氧化还原适应调节机制参与过表达NOX4诱导的血管内皮细胞铁死亡抵抗（1）LPS诱导HUVECs内NOX4蛋白高表达,Fer-1下调LPS诱导的HUVECs内NOX4蛋白表达;（2）过表达NOX4升高LPS诱导的HUVECs内ROS水平、加重线粒体损伤,上调LPS诱导的HUVECs内抗铁死亡蛋白FTH、GPX4和x-CT表达、下调促铁死亡蛋白PTGS2表达;（3）过表达NOX4上调血管内皮细胞NRF2蛋白表达,ROS清除剂NAC能够降低NOX4过表达和LPS诱导的HUVECs内NRF2蛋白表达水平;（4）过表达NOX4增加HUVECs增殖活力,抑制NRF2后降低了NOX4过表达的HUVECs的增殖活力,诱导了细胞死亡;抑制NRF2后下调NOX4过表达的HUVECs内抗铁死亡蛋白GPX4、x-CT和FTH表达、上调促铁死亡蛋白PTGS2表达。5.血清铁离子水平是影响急性心肌梗死发病的独立危险因素,铁死亡可能参与急性心肌梗死发病过程（1）通过分析急性心肌梗死患者（疾病组）和冠心病患者（对照组）的临床病史资料及相关血生化检测结果,发现两组患者在性别分布、吸烟史、LDL/HDL、叶酸和空腹血糖水平方面差异存在统计学意义（P＜0.05）。（2）通过血清学分析发现,急性心肌梗死患者与冠心病患者在血清铁离子和血清MDA水平存在统计学差异（P＜0.05）。（3）二元Logistic回归分析显示血清铁离子水平是影响急性心肌梗死发病的独立危险因素（OR=11.042,95%CI=1.769-68.923）。（4）进一步对急性心肌梗死患者和冠心病患者的血清铁离子与血脂和血清MDA水平行相关性分析发现,两组患者中随着血清铁离子水平的增高,血清MDA水平、LDL和LDL/HDL也呈增高趋势。两组患者血清MDA水平与血脂水平的相关性分析结果显示,在急性心肌梗死组患者中,随着血清MDA水平增高,血清LDL水平及LDL/HD也呈增高趋势,但是在冠心病患者中未见这种变化趋势。结论1.LPS诱导HUVECs炎症损伤和细胞衰老;2.铁死亡参与血管内皮细胞炎症和衰老发病过程,抑制铁死亡可减轻LPS诱导的血管内皮细胞炎症和细胞衰老;3.NRF2通过激活胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白系统-谷胱甘肽-GPX4轴和抑制铁自噬信号通路相关因子改善LPS诱导的血管内皮细胞铁死亡;NRF2通过抑制HMGB1、IL-6和TNF-α等炎症蛋白表达减轻LPS诱导的血管内皮细胞铁死亡依赖的炎症;4.NRF2通过抑制衰老相关蛋白p53/p21表达减轻LPS诱导的血管内皮细胞衰老;5.NOX4/ROS/NRF2调节轴参与LPS诱导的血管内皮细胞铁死亡调控,NRF2介导的氧化还原适应改善促ROS生成因子NOX4激活诱导的血管内皮细胞损伤和铁死亡,是血管内皮细胞重要的氧化稳态调节因子;6.血清铁离子水平是影响急性心肌梗死发病的独立危险因素,铁死亡可能参与冠状动脉粥样硬化急性血管事件发病过程。创新点及研究意义创新点:1.本研究证实抗氧化防御因子NRF2可通过抑制铁死亡减轻LPS诱导的血管内皮细胞炎症和细胞衰老。2.进一步从细胞氧化还原稳态调节机制证实NOX4/ROS/NRF2通路参与血管内皮细胞铁死亡调控。研究意义:通过建立LPS诱导的HUVECs炎症损伤和衰老模型,证实了铁死亡参与LPS诱导的血管内皮细胞炎症和细胞衰老过程,抑制铁死亡可明显减轻LPS诱导的血管损伤。并且进一步从细胞铁死亡、炎症、衰老及氧化还原稳态调节等角度揭示了NRF2发挥抗血管内皮细胞氧化损伤的新作用。此外,从临床数据分析发现血清铁离子水平是影响急性心肌梗死发病的独立危险因素,铁死亡可能参与冠状动脉粥样硬化急性血管事件发病过程。由此,本研究从体外和体内两方面证明针对铁死亡的治疗将为改善动脉粥样硬化相关血管疾病愈后提供新的依据。