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铁代谢作为微生物的基础代谢之一,维持细胞的催化代谢酶和DNA生物合成等多种重要生理过程。然而环境中有限的铁离子浓度阻碍了微生物的正常繁殖和位点适应,不仅影响各类病原细菌的致病性,也影响生防有益细菌的拮抗活性。在长期的生物进化过程中,微生物已发展出多种铁代谢途径,其中最重要的就是通过分泌高亲和力的铁螯合剂-嗜铁素来协助其在低铁环境获取铁离子;而一些被发现的新嗜铁素及相应的铁代谢途径进化经常是由水平基因转移(horizontal gene transfer,HGT)获取的外来基因(簇)所致。另一方面,铁代谢全局调控因子(Ferric uptake regulator,Fur)作为中央枢纽广泛存在于微生物中,协调不同铁代谢途径间的平衡。本实验室前期工作发现4株Burkholderia seminalis菌株S9,0901,DSM23518,和R456分别扮演了环境腐生,植物和人体病原以及拮抗生防的角色,而这些特异性的角色很大程度是由于每个菌株在长期的进化过程中能适应特定位点,通过多维组学结合表型分析,我们发现这些位点适应很大程度是由于菌株通过HGT,位点差异性表达以及甲基化等表观遗传手段丰富了各自的铁代谢途径,特别是能通过分泌抗菌物质c FP(环二肽)拮抗病原真菌的菌株R456,其基因组中存在一个HGT驱动的位点特异表达的铁相关基因簇。因此,以拮抗菌株R456为对象,深入开展来源于HGT的新型铁代谢及其与Fur之间关系研究,不仅将极大地丰富微生物铁代谢网络,也有利于更好地利用R456等有益微生物。通过研究,本文取得了以下主要结果:首先,本研究在B.seminalis R456中鉴定出了从藻类水平基因转移的新型非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPSs)基因簇,这也是国际上首次发现的藻类向细菌转移的基因簇。基因组分析发现该菌株同时具有嗜铁素ornibactin和pyochelin的合成基因簇以及该水平转移基因簇NRPS-R456。该NRPS基因簇可能主要通过影响嗜铁素合成,铁胁迫生长,生物膜合成和游动性等铁代谢相关表型参与铁代谢途径。通过高效液相色谱-质谱联用,鉴定该菌株在缺铁条件可以合成ornibactin及相关同系物,两种pyochelin异构体。进一步通过制备色谱和镍离子层析柱分离纯化两类嗜铁素并鉴定其活性,结合质谱数据和该基因簇的生信分析结果,预测该基因簇合成一个具有嗜铁素活性的新型多肽;同时该基因簇核心基因的缺失显著降低ornibatcin和pyochelin合成,荧光定量PCR也显示突变体中这两种嗜铁素直接调控因子的表达明显下调。其次,本研究鉴定出上述NRPS-R456基因簇与B.seminalis R456中的传统铁代谢全局调控因子Fur存在相互作用。首先,本研究显示在富铁条件下,Fur的缺失明显使胞内铁含量上调,过氧化氢酶活性降低,过氧化氢耐受性明显减弱,证实了Fur对于铁平衡的调控作用,避免富铁条件下铁过量吸收;其次,为了明确Fur究竟通过影响哪些蛋白来行使其调控功能,我们通过原核表达并制备抗体进行免疫蛋白共沉淀,并通过细菌双杂验证由Fur抗体钓取的蛋白与Fur的互作,经质谱鉴定与Fur互作的蛋白包括核糖体蛋白S1(Rps A),热激蛋白(Gro EL),转录终止蛋白(Nus A),醛脱氢酶(Adh E),天冬氨酸连接酶(Asp S),磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck G)和热激蛋白(Dna K);最后,荧光定量PCR鉴定出NRPSR456和Fur在彼此的突变体中都会下调表达,生信分析发现NRPS-R456中存在一个Fur二聚体结合的识别序列,且酵母单杂显示富铁条件下Fur蛋白可以与识别序列结合,从而抑制该基因簇的表达,这些结果清楚地显示了NRPS-R456或许与Fur蛋白协同调控细菌的铁代谢。最后,本论文通过Tn5转座子突变法鉴定出NRPS-R456控制的铁代谢与细菌的拮抗能力相关。首先通过Tn5随机插入构建包含997个R456转座子突变株的突变体库;然后通过缺铁培养基筛选,获得3个明显在缺铁环境生长受限的突变体,通过对峙培养,筛选到10个拮抗水稻纹枯病菌能力明显减弱的突变体,另有1个突变体两种表型均减弱;最后通过反向PCR法鉴定插入基因,结果发现,具有双重减弱表型的突变株转座子插入至NRPS-R456(R456＿2057)中,缺铁环境生长受限的3个突变体,转座子分别插入到参与嘌呤途径的甘氨酰胺合酶(Pur L),天冬氨酸转氨酶(Asp B),铁硫簇蛋白;拮抗减弱的10个突变体中,有8个突变体转座子分别插入到糖基转移酶(Glycosyl transferase),组蛋白(Histone H1),核糖体甲基转移酶(50S ribosomal protein L11 methyltransferase),膜完整性相关转运蛋白(Pqi C),t RNA尿苷合成酶(Mnm G),硫酸盐转运蛋白(Yei H),过氧化氢酶(Catalase),硫酸盐腺苷转移酶(Cys D),其余3个突变体转座子均插入到质粒上,其中2个突变株的Tn5转座子插入至同一假设蛋白(R456＿6210),1个突变株转座子插入至另一假设蛋白(R456＿6327)。综上,本论文在拮抗细菌B.seminalis R456中鉴定出一个从藻类水平转移获得的NRPS-R456基因簇,其不仅单独具有全局性的铁代谢调控功能,且与传统的铁代谢全局调控因子Fur存在相互作用,随机插入突变分析显示其特异的拮抗能力或许也很大程度与这个NRPS-R456负责的铁代谢相关,这一研究结果不仅突出了水平转移在细菌铁代谢进化中的作用,也强调了铁代谢进化在细菌适应特定生态位点进而发挥特定生物学功能中的重要性。