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猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是猪的一种传染病,主要引起母猪发情和繁殖障碍,生长猪的呼吸道症状。该病首次发现于美国,随后在欧洲大面积暴发。该病最初发病传播迅速,目前世界大部分国家和地区已有该病报道。PRRSV从出现至今已经历30余年演变,目前仍未得到有效控制。中国1996年首次分离到PRRSV至今已经历20余年的演化,期间经历了三次大的流行高峰期,给我国养猪业带来了巨大经济损失。国内针对PRRSV的防控仍主要依靠疫苗接种,但各种疫苗都存在一定弊端。目前我国PRRS毒株种类多,多种毒株混合感染情况严重,不同毒株重组概率增加,产生新的变异毒株。此外,疫苗使用不当,管理不规范,质量不一,疫苗毒散毒、毒力返强等问题日益突出。种猪检疫不严格,引种不规范,给外来毒株的引入提供了便利。本研究从病原的分子检测和鉴别方法入手,并通过病原分离鉴定、不同类型PRRSV抗原性及致病性测定等,对河南及其周边地区猪群中PRRSV的分布、感染和流行情况、致病性及不同毒株相互之间的交叉保护作用等进行了系统研究,以期为PRRS的临床诊断、疫情预警、疫苗研发及有效防控等提供参考依据。1.PRRSV1和PRRSV2毒株单一和双重RT-PCR方法的建立为了解和掌握河南省PRRS的流行概况,针对PRRSV1和PRRSV2的ORF5基因以及PRRSV2的Nsp2基因,设计两对特异性引物用于PRRSV1和PRRSV2的双重RT-PCR扩增,设计一对鉴别引物来鉴别不同类型PRRSV2（经典、HP-PRRV及类NADC30）毒株,实现了两种不同PRRSV目的基因和不同PRRSV2毒株基因在同一反应体系中的同时扩增。结果显示PRRSV2Nsp2鉴别RT-PCR方法对不同类型PRRSV2的最低检测量为2.2×10-1ng3.1×10-1ng,PRRSV1和PRRSV2双重RT-PCR的最低检测量分别为3.39×10-2ng、3.67×10-2ng。且上述RT-PCR方法具有高度特异性、敏感性和可重复性。通过对369临床疑似PRRSV感染样品的检测进一步验证了该方法的可靠性和实用性。PRRSV2 Nsp2鉴别RT-PCR共检测出临床阳性样品47份。在检测的47份阳性样品中,HP-PRRSV和类NADC30毒株的检出率占总阳性率的93.62%,未检测到经典毒株。369份样品中单一PRRSV2阳性114份,阳性率为30.89%;单一PRRSV1阳性16份,阳性率为4.34%;PRRSV1和PRRSV2同时阳性11份,阳性率为2.98%;单一与双重RT-PCR检测结果吻合率为100%。综上所述,目前河南省PRRS的流行主要以类NADC30及HP-PRRSV毒株为主;此外,此次检测结果首次发现河南省感染有PRRSV1,并且与PRRSV2存在混合感染。PRRSV2毒株在田间流行呈现多样化;PRRSV1和PRRSV2的混合感染加大了临床诊断和防控难度。2.PRRSV2不同类型毒株的分离鉴定及重组、变异分析对利用PRRSV2鉴别RT-PCR及PRRSV1和PRRSV2双重RT-PCR扩增出的阳性样品进行病毒的分离与鉴定。共分离PRRSV2毒株20株,并对其Nsp2、ORF5及部分毒株全基因序列进行了测定及分析。结果显示9株分离株与国内目前流行的类NADC30毒株核苷酸相似性较高;6株与国内流行的HP-PRRSV毒株的核苷酸相似性较高;5株与HP-PRRSV疫苗株JXA1-R的相似性较高。对HENXX-8、HENXX-9及HENJY-2毒株的全基因序列扩增、变异及重组分析,三株分离物基因组存在明显的重组事件,且重组模式不同。HENXX-9毒株是由HP-PRRSV和类NADC30毒株的重组体,HENXX-8、HENJY-2毒株为类NADC30毒株与HP-PRRSV的重组体。病毒生长曲线显示三株分离物的增殖能力从高到低依次为HENXX-9>HENXX-8>HENJY-2。不同毒株间的重组更加剧了临床PRRS的防控难度。3.PRRSV1毒株的分离鉴定、全序列分析及分子流行病学调查本研究从临床样品中共检出PRRSV1阳性样品16份,获得6个PRRSV1 ORF5基因;分离鉴定出1株PRRSV1毒株,命名为HENZMD-10。依据ORF5基因序列构建的遗传进化树显示,6株PRRSV1的ORF5基因之间遗传距离较远;分离株HENZMD-10的全基因与PRRSV2代表毒株VR2332的核苷酸序列相似性为62.1%;与PRRSV1代表毒株Lelystad virus的核苷酸序列相似性为89.1%。遗传进化分析显示,该毒株与国内同类毒株NVDC-NM1-2011、LNEU12、BJEU06-1和FJEU13的亲缘关系最近。对HENZMD-10的Nsp2编码区进行分析,其在Nsp2区缺失了27个核苷酸,而国内报道的上述4个同类毒株在该区域仅缺失15个核苷酸,国外KUN-07、EuroPRRSV、MLV-DV PRRSV1毒株在该区域缺失多达50222个核苷酸。本研究首次从河南地区猪群中分离到PRRSV1毒株,全基因重组分析显示HENZMD-10未发生重组现象。虽然目前PRRSV1和PRRSV2之间尚未发现有重组毒株产生,但是两种毒株在田间猪群中的同时存在,无疑给目前PRRSV的防控增加了难度。因此应扩大检测范围、对田间PRRSV1与PRRSV2进行持续监测,及时掌握其流行动态,为其临床防控提供科学依据。4.不同PRRSV毒株的体外交叉中和试验本实验针对目前田间流行毒株多样、病情复杂现状,制备了商品疫苗及目前田间流行毒株的兔抗高免血清,并通过体外血清中和试验来验证不同PRRSV的交叉保护作用。结果显示JXA1-R高免血清对不同类型毒株的交叉免疫保护高于VR2332R及HENXX-8组高免血清;且对经典毒株的免疫保护水平最高,中和效价可以达到1:114;而兔抗VR2332-R血清对HP-PRRSV毒株的中和效价最低,仅为1:11;兔抗HENXX-8高免血清对重组毒株HENJY-2毒株能提供较高的免疫保护,但对JXA1-R的免疫保护较低;兔抗JXA1-R、VR2332-R血清对类NADC30毒株均能够提供较好的免疫保护。5.PRRSV和GETV双重RT-PCR检测方法的建立与应用盖他病毒（Getah virus,GETV）可感染猪并引起和PRRS相类似的临床表现,且两者可混合感染而难以区分。我国检测PRRSV和其他诸多病毒的多重PCR文献已比比皆是,但尚无同时检测PRRSV和GETV方法的报道。为此,作者根据GenBank中公布的PRRSV和GETV全基因序列,设计了两对分别扩增PRRSV ORF7基因和GETV Cap基因片段的引物,通过反应条件的优化及特异性、灵敏性和重复性试验,首次建立了可同时检测PRRSV和GETV的双重RT-PCR方法。结果显示,该方法可以同时扩增出PRRSV 633 bp和GETV 316 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒等其他相关病毒扩增结果均为阴性。对GETV和PRRSV的cDNA最低检测量分别为2.48×10-4ng和2.50×10-5ng。用建立的双重RT-PCR方法对河南15个地市92个猪场的136份临床疑似PRRS发病猪样品进行检测,共从58个猪场检出PRRSV单一阳性样品44份,阳性率为32.4%;GETV单一阳性样品7份,阳性率为5.15%;GETV和PRRSV混合感染样品8份,阳性率为5.88%。检测结果与单一RT-PCR结果吻合率达100%。该方法为GETV和PRRSV的快速检测、鉴别诊断和分子流行病学研究等提供了更简便的技术手段。