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溶瘤病毒（Oncolytic Virus,OVs）是一种天然或经基因工程技术改造的病毒,可以选择性感染肿瘤细胞,并在肿瘤细胞内大量复制,最终裂解肿瘤细胞,释放子代病毒,扩散并感染周围的肿瘤细胞,从而抑制肿瘤生长。溶瘤病毒还会诱发机体的局部和全身免疫,激活T细胞,抑制肿瘤进展。近年来随着基因工程技术的进步,溶瘤病毒免疫疗法发展迅速,已有四款溶瘤病毒产品上市,极大推动了溶瘤病毒的发展。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4）是一种抑制性免疫检查点受体,是免疫反应重要的负性调节因子,在调节T细胞的反应中起着关键作用。T细胞的激活需要T淋巴细胞表面表达的共刺激分子CD28,与抗原呈递细胞（APC）上的B7分子结合,引起T细胞的共刺激并促进其存活、增殖以及产生细胞因子。CTLA4与CD28的分子结构相似,竞争性结合B7,结合后传递抑制性信号,抑制T细胞的启动,终止免疫反应。我们利用这一特性,将人源CTLA4抗体构建在PR8流感病毒骨架质粒上,通过反向遗传学技术（RG）拯救获得重组溶瘤病毒,病毒在复制过程中,表达huCTLA4抗体,并通过体内外实验评价其溶瘤效果。选取A/Puerto Rico/8/34（H1N1）（PR8）流感病毒株为骨架构建重组流感病毒。PR8是高滴度鸡胚适应的RNA流感病毒株,含有8个基因片段,pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M、pHW198-NS。本研究将huCTLA4抗体的重链、轻链分别构建在pHW192-PB1、pHW193-PA片段上,克隆入pHW2000载体,成功构建重组质粒pFlu-huCTLA4-PB1、pFlu-huCTLA4-PA,琼脂糖凝胶电泳验证其大小与预期一致,表明重组质粒构建成功。将重组质粒pFlu-huCTLA4-PB1、pFlu-huCTLA4-PA与PR8的其余6个骨架质粒pHW191-PB2、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M和pHW198-NS等量混匀,按照QIAGEN转染试剂盒说明书,转染至COSⅠ与MDCK的共培养细胞中,成功拯救获得重组病毒,命名为rFlu-huCTLA4。在SPF鸡胚中连续传代,最终血凝效价稳定在2~8～2~9,病毒滴度达108~9 TCID50/mL。Trizol法提取尿囊液中的重组溶瘤病毒rFlu-huCTLA4的RNA,反转录为c DNA,PCR扩增溶瘤病毒PB1、PA片段,PCR产物测序结果显示,其大小及序列符合预期。鸡胚扩毒后经蔗糖浓度梯度获得纯化病毒,负染固定后透射电镜观察到其形态结构及大小分布符合流感病毒的典型特征。证明成功拯救获得一株嵌合huCTLA4抗体基因的重组溶瘤病毒rFlu-huCTLA4。经体内外实验验证重组溶瘤病毒rFlu-huCTLA4的生物学活性。重组溶瘤病毒rFlu-huCTLA4分别感染HepG2、MDCK细胞,测定其生长曲线,发现其血凝效价从12h开始升高,72h达峰值,病毒滴度变化趋势与之相符,72h达峰值为10~9 TCID50/mL。为验证重组病毒rFlu-huCTLA4是否能成功表达huCTLA4,rFlu-huCTLA4毒株感染9日龄鸡胚,分别在24h、48h、72h、96h收取鸡胚尿囊液,经G蛋白层析纯化抗体,经huCTLA4抗体ELISA试剂盒检测抗体含量,结果表明抗体含量随时间延长而增多。随后用正常肝细胞系MIHA、肝癌细胞系HepG2、Huh7,经MTS、结晶紫实验验证了其可显著抑制肝癌细胞活力,而对正常细胞没有影响,并表现出来时间和剂量依赖性。流式细胞术检测细胞凋亡,证明其可显著诱导肝癌细胞死亡,效果随剂量增加而增强。在肝癌PDX小鼠模型和免疫功能健全的肝癌小鼠模型上验证其体内溶瘤效果。分别分3组进行,PBS、PR8、rFlu-huCTLA4,每组8只,分别瘤内注射PBS、PR8、rFlu-huCTLA4,100ul/48h,观察发现PDX小鼠rFlu-huCTLA4组小鼠肿瘤体积变化及小鼠体重变化略小于PR8组,而免疫功能健全的肝癌小鼠rFlu-huCTLA4组肿瘤体积增长明显比其他组缓慢;肝癌小鼠模型接种7d后取小鼠脾流式细胞术检测CD45+、CD3+、CD4+、CD8+、CD69+含量,结果显示rFlu-huCTLA4组小鼠CD69+T细胞含量是最高的,分析结果及文献调研,结果符合预期,实验结果表明:rFlu-huCTLA4在免疫系统健全的小鼠体内能更有效的激活T细胞,靶向抑制肿瘤生长。综上所述,体内外实验证明,成功拯救了携带huCTLA4的重组溶瘤病毒株,可在体内外靶向杀伤肿瘤细胞,有效激活T细胞,激活免疫系统,抑制肿瘤细胞生长。有望成为新的肝癌治疗药物,为肝癌的临床治疗提供新的策略。