猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, MHP)可引起猪地方性流行性肺炎(Enzootic Pneumonia, EP),也是猪呼吸道疾病综合症的重要原发性病原之一。更重要的是,MHP的感染易造成多种其它病原微生物的继发感染,增加猪呼吸道疾病的发病率和死亡率,给养猪业带来了巨大的经济损失。本研究开展MHP的病原分离鉴定、病原检测方法、重组沙门氏菌基因工程疫苗和重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因工程疫苗进行研究,为我国MHP的诊断、预防和控制提供新的方法,为MHP致病机制的研究提供基础。主要研究内容如下：1.MHP的分离鉴定及基因序列分析从我国送检的临床病例中有典型或凝似MHP症状的猪肺组织中分离出了1株MHP菌株,命名为HNYY。通过菌落形态观察、电镜观察、基因序列分析,分离鉴定的MHP菌株可以在MHP固体培养基中形成典型的“煎蛋样”菌落,菌落中心隆起,呈致密的小颗粒,中央颗粒较粗。通过电镜负染观察其形态,大多数为圆形。通过对MHP特异性的P36、P46以及16sRNA基因片段进行扩增测序分析,分离株的P36、P46和16sRNA序列与NCBI上报道的MHP序列进行比对,发现其同源性分别为100%、93%和96%。用MAGE4.0软件对这些基因进行进化分析,发现该分离株与国际232菌株的进化关系最近。2.MHP分离株的致病性研究筛选12头MHP和PRRSV血清抗体阴性的21日龄仔猪,分成两组。用分离的MHP菌株进行连续2次气管注射107个CCU的菌液,连续观察28天。分别对感染MHP后仔猪的体温、生长指标、精神状况、临床表现进行监测,对血清抗体和剖解后的组织病理切片和免疫组化进行分析。结果表明感染后仔猪的体温并没有升高,食欲和精神状况变化也不大,也并没有显示很明显的MHP临床症状。直到感染26天左右,体温才开始升高,部分猪也表现出咳嗽。但剖解后肉眼并没有观察到肺组织典型的MHP实质性的肉变或虾样肉变。通过测定平均日增重结果显示感染组的平均日增重比空白对照组低。血清抗体检测结果显示感染组并没有完全发生阳转。通过病理切片分析发现所有的肺组织均表现有不同程度的间质性肺炎和支气管纤毛上皮细胞脱落,而对照组均正常。用黏附素蛋白制备的多抗进行免疫组化分析结果显示感染组中所有的肺组织均为MHP阳性,说明分离的MHP菌株可感染仔猪,但并未造成严重的发病,初步鉴定为弱毒株。3. Real-time PCR检测方法的建立针对MHP保守的特异性基因——P36制备TaqMAN探针,建立用于检测MHP的FQ-PCR方法。该方法敏感度可达1×100拷贝/μ1,对批内起始浓度为1.0×108、1.0×107、1.0×106拷贝/μ1的pMD18-P36标准品的Ct值得变异系数(CV)分别为：0.6、0.5、0.5。批间起始浓度为1.0×108、1.0×107、1.0×106拷贝/μ1的pMD18-P36标准品的试验的Ct值变异系数(CV)分别为：7.6、7.9、3.4。检测的灵敏度比普通PCR高100倍。说明该方法具有良好的特异性、稳定性和重复性。4.在大肠杆菌中的表达及反应原性分析根据MHP免疫原性基因相关的研究报道,我们选取主要的免疫原性基因P46、P65、P97R1和NrdF进行分析,结果显示P46基因序列中含有3个TGA密码子,分别位于碱基序列的208、301和760位；P65基因序列中含有1个TGA密码子,位于碱基序列的631位；而P97R1序列是黏附素基因中起主要黏附作用的位点,位于黏附素基因P97序列中的2560-2889,序列中无TGA密码子；NreF基因序列编码一个11 Kda蛋白,无TGA密码子。分别将P46、P65、P97R1NrdF构建在原核表达质粒pGEX-KG于宿主菌JM105中进行表达并纯化蛋白,其大小分别为72 KDa,91 KDa,62 KDa和50 KDa。5.表达MHP保护性抗原的重组沙门氏菌株的构建分别将P46、P65、P36、P97R1NrdF基因片段与沙门氏菌asd平衡表达质粒pYA3493进行连接,制备重组平衡表达质粒pYAP46、pYAP65、pYAP36和pYAP97R1N。将这些质粒分别电转化猪霍乱沙门氏弱毒株C501中,制备重组菌株C501(pYAP46)、C501(pYAP65)、C501(pYAP36)、C501(pYAP97R1NrdF)均保留了亲本株C501的生化特性和抗原表型,能稳定遗传并高效表达MHP的P36、P46、P65和P97R1NrdF抗原。6.MHP重组沙门氏菌基因工程疫苗对小鼠免疫效果的观察利用表达MHP免疫原形基因P46、P65、P36、P97R1NrdF片段的重组猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C501(pYAP46)、C501(pYAP65)、C501(pYAP36)、C501(pYAP97RlNrdF),制备猪肺炎支原体重组沙门氏菌基因工程疫苗,利用BALB/c小鼠检测免疫原性。将4×108CFU重组菌株C501(pYAP46)、C501(pYAP65)、C501(pYAP36)、C501(pYAP97RlNrdF)分别进行肌肉免疫和口服免疫。重组疫苗C501(pYAP46)免疫组血清中未检测到抗P46特异的IgA抗体,但可检测到特异的IgG抗体,而肺组织中只有肌肉免疫组中可检测到特异的P46-IgG抗体。重组疫苗C501(pYAP65)免疫后的实验结果显示特异性的P65抗体水平与P46结果类似,免疫小鼠后血清和肺组织中也无特异的IgA抗体,也是肌肉免疫途径效果好。与之不同的是,免疫小鼠后血清中诱导的特异的P65-IgG抗体水平比P46-IgG高,且比商品化168活疫苗对照组高,差异显著。而肺组织中产生的特异的P65-IgG抗体水平却比P46-IgG低。重组疫苗C501(pYAP36)和重组疫苗C501(pYAP97R1NrdF)免疫小鼠后血清和肺组织中均可以诱导机体产生特异的IgA和IgG抗体,免疫效力优于P46和P65抗原。C501(pYAP36)口服免疫比肌肉免疫组产生的P36-IgA抗体滴度高,但差异不显著。相反,重组口服疫苗比肌肉免疫组产生的P36-IgG抗体滴度却低,差异也不显著。肺组织中肌注免疫168活疫苗产生特异的P36-IgA抗体滴度最高,与重组菌C501(pYAP36)免疫组相比差异显著。口服免疫重组菌C501(pYAP36)的P36-IgG抗体滴度最高,与其他免疫组相比差异显著。重组疫苗C501(pYAP97R1NrdF)无论是口服免疫还是肌肉免疫均比168活疫苗对照组产生的P97R1N-IgA和IgG抗体滴度高,且差异显著。肺组织中,重组疫苗C501(pYAP97R1NrdF)也可以检测到特异的高水平的P97R1N-IgA和P97R1N-IgG抗体。本研究通过用不同的抗原刺激免疫后小鼠的脾淋巴细胞来测定细胞因子水平的结果中可以看出,构建的重组疫苗免疫动物后可以刺激小鼠产生细胞免疫,其中重组疫苗C501(pYAP97R1N)诱导的细胞免疫最高。7.MHP重组沙门氏菌基因工程疫苗对仔猪的免疫保护研究依据小鼠免疫效力实验的结果,选用18头21日龄的猪肺炎支原体和PRRSV血清抗体阴性的仔猪作为实验研究的动物,分成4组,分别为四种重组猪霍乱沙门氏菌弱毒株的多价重组疫苗C501(pYAP46/P65/P36/P97R1NrdF)组、串联重组单苗C501(pYAP97R1NrdF)组、进口商品化疫苗M+PACR组和未免疫对照组,考察该疫苗对该年龄段猪的免疫保护MHP的情况。分别用3×109CFU的重组四价苗C501(pYAP46/P65/P36/P97R1NrdF)和重组单苗C501(pYAP97R1NrdF)进行肌肉免疫接种。通过建立的ELISA和商品化的ELISA试剂盒对免疫仔猪进行抗体水平的测定。重组疫苗免疫仔猪后可诱导机产生针对各种免疫原特异的IgM抗体,其中P65-、P97R1-、P97R1N-IgM抗体滴度较商品化疫苗组高,单苗免疫组中特异的IgM抗体较联苗组高。重组疫苗免疫仔猪后血清中均可产生特异的IgG,而无特异的P46-和P65-IgA抗体产生,此外,血清中也无P36-IgA抗体产生。实验结果中重组疫苗免疫仔猪后均可产生高于商品化疫苗产生针对P46-、P65-、P36-、P97R1-和P97R1N特异的IgG抗体；重组单苗C501(pYAP97R1NrdF)产生的特异的P97R1-和P97R1N-IgG抗体高于重组四价苗C501(pYAP46/P65/P36/P97R1NrdF)。但根据商品化M.hyo抗体的ELISA试剂盒检测结果显示商品化疫苗免疫组的抗体水平显著高于重组疫苗免疫组。说明M.hyo特异抗体水平与疫苗免疫保护没有相关性。用IgG1和IgG2a来抽象的评价重组疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫效果,发现重组疫苗既可以诱导体液免疫又可诱导细胞免疫,其中细胞免疫水平略高于体液免疫水平。对血清中的IL-6和TNF-α细胞因子检测,结果显示未免疫攻毒组血清中的IL-6和TNF-α炎性细胞因子水平显著高于各免疫组；而其中商品化疫苗组的TNF-α细胞因子水平显著高于重组单苗C501(pYAP97R1N)免疫组,重组联苗免疫组高于重组单苗免疫组。从病理切片显示几乎所有组攻毒后都有不同程度的病理变化,但从攻毒后肺部病理评分和临床剖解病理变化来看,重组疫苗免疫组的肺脏组织损伤明显比商品化疫苗免疫组和未免疫空白组弱,差异显著。从以上结果我们可以看出,多价重组疫苗免疫保护效果比商品化疫苗好,重组疫苗C501(pYAP97R1N)免疫仔猪后攻毒感染MHP引起的肺部损伤最轻,起到免疫保护的效果最好。有望成为今后预防锗肺炎支原体新型的基因工程疫苗。8.MHP重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因工程疫苗的研究本研究以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)血清1型双基因缺失株SLW03和猪肺炎支原体为材料,分别克隆APP脲酶结构C(UreC)基因的上下同源臂、MHP主要免疫原性蛋白——乳酸脱氢酶(P36)基因和强启动子基因ner,将强启动子序列插入到含脲酶基因核糖体结合位点的P36基因上游,并插入到脲酶结构C基因的上下同源臂中间,构建获得含修饰过的P36基因并缺失脲酶C基因的APP突变株SLW36,该突变株不含抗生素抗性基因。对突变株进行生物学特性、生长特性以及免疫活性进行分析,试验结果显示构建的突变株比亲本株的毒性更低,更安全,异源基因P36的插入及脲酶结构基因的失活也没有影响其生长特性,通过SDS-PAGE和Western blot分析也表明了异源基因P36能够在APP染色体中表达,通过免疫反应实验结果显示突变株免疫小鼠后可以产生抗P36特异的IgG抗体和微量的猪肺炎支原体抗体,表明猪传染性胸膜肺炎放线杆菌弱毒株可以表达异源基因并能诱导产生异源基因特异的抗体,说明其作为细菌疫苗载体的可行性,并有望用于多价基因工程疫苗的研究。