汞是一种毒性极强的重金属元素,其有机化合物（甲基汞）具有强神经毒性、亲脂性和高生物富集性特征。自日本发生震惊世界的―水俣病‖事件以来,甲基汞（MeHg）引起的环境问题受到全世界的广泛关注。无机汞在生物和非生物因素下,都可以转化高毒性的MeHg,该过程是汞生物地球化学循环的重要组成部分,也是汞进入食物链的关键过程。上世纪60年代,Jensen等首次发现微生物汞甲基化以来,国内外开展了大量关于微生物汞甲基化的研究,并证实硫酸盐还原菌（sulfate reducing bacteria,SRB）、铁还原菌（Iron-reducing bacteria,FeRB）及产甲烷菌（Methanogens）等是厌氧环境中的主要汞甲基化微生物。2013年,随着厌氧汞甲基化关键基因簇hgcA/B的发现,汞的微生物甲基化进入基因水平研究的时代。可见,汞的微生物甲基化研究已成为环境领域的重点研究方向。湿地环境是汞的活性库,具有较高的汞累积率和MeHg产率,是环境中最重要的汞甲基化场所。通常,自然湿地主要有沼泽地、泥炭地、湖泊、河流、海滩和盐沼,而人工湿地包括水库、水稻田和池塘等。水库环境有利于汞的活化、甲基化和生物富集,是典型的―汞敏感生态系统‖。三峡水库是世界瞩目的特大型年调节水库,水位涨落使其形成一个面积约为350km²的大型消落带。每年10月到次年1月,水库水位处于全年最高（175 m）,因而175 m以下的陆地都被江水淹没。从1月开始,水位逐渐下降,到6月份降至全年最低（145 m）,土壤出露成陆。在淹水期,被淹没的土壤和植物会释放大量有机质和营养元素,刺激汞甲基化微生物生长,从而促进MeHg的生成及释放。在落干初期,消落带土壤MeHg含量逐渐降低,但随着落干时间的延长,土壤MeHg又呈现出一种增加的趋势。对于落干后期的消落带土壤而言,由于其长时间暴露在空气中,因而并不是一个严格的厌氧环境。那么,土壤中的MeHg又从何而来?是否存在除SRB和FeRB等厌氧菌之外的汞甲基化微生物呢?如果存在,那其汞甲基化途径又是怎样的呢?三峡水库这种周期性的水位调度方式使其不同于一般的湿地环境,因此,很有必要探究微生物在其领域的汞甲基化行为。我们采用野外调查实验对不同水位高程土壤汞含量进行分析时,发现土壤MeHg含量在干湿交替区（DFA）显著高于未淹没区（NIA）和淹没区（IA）,说明周期性水位波动能促进土壤MeHg的生成。然而,消落带土壤中%MeHg（MeHg占THg的比率）含量仅为0.08%-0.99%,远低于其它水生生态系统,说明三峡水库消落带土壤的汞甲基化程度仍处于一个较低的水平。通过对消落带不同水位高程土壤可培养细菌总数（Total culturable bacteria,TCB）的分布特征研究发现,周期性干湿交替能增加土壤TCB的含量,且消落带10-20 cm土层土壤TCB与甲基汞含量呈显著或极显著正相关关系,表明土壤细菌在汞甲基化方面具有极其重要的作用。由于本试验采用的CFU法是在有氧条件下进行的,测得的土壤TCB代表土壤中活菌总数,因而推测土壤中存在某些对汞甲基化起主导作用的需氧性微生物。然而,土壤微生物的代谢类型较多,土壤TCB仅能反映土壤中一小部分可培养细菌的变化特征,而土壤中绝大部分微生物都是不可培养的。因此,我们进一步采用454高通量测序的分析手段,探讨了周期性水位涨落对土壤微生物群落结构以及多样性的影响。结果发现,土壤细菌和古菌的OTU数量及Alpha多样性指数在干湿交替区（DFA）均高于未淹没区（NIA）和淹没区（IA）,表明周期性地水位波动能增加土壤微生物群落的丰度和多样性。此外,在消落带土壤中共检测到了6种可能具有汞甲基化能力的Deltaproteobacteria、4种Firmicutes和2种Methanomicrobia。其中,Deltaproteobacteria和Methanomicrobia的相对丰度在DFA高于NIA和IA,这可能是经历过周期性干湿交替影响的土壤中MeHg含量较高的原因。然而,虽然Deltaproteobacteria含有强的Hg甲基化因子,但其在消落带土壤中的含量较低;Methanomicrobia的家族具有相对较高的丰度,但其Hg甲基化能力却很弱。这些可能是导致TGR土壤汞甲基化水平很低的原因。由于三峡库区消落带并不是一个严格的厌氧环境,基于上述研究结果,我们推测土壤中可能存在除上述厌氧汞甲基化因子以外的微生物。因此,我们进一步以三峡水库石宝寨典型消落带为研究对象,从165-160 m高程土壤中分离筛选得到4株在有氧或兼性厌氧条件下具有汞甲基化能力的细菌菌株,并通过生理生化和16S rRNA基因测序鉴定,对这些菌株进行了分类鉴定。结果表明,菌株TGRB1和TGRB4为专性需氧的恶臭假单胞菌,TGRB2为微需氧的荧光假单胞菌。TGRB5为一株兼性厌氧菌,但由于其16S rRNA基因鉴定与生理生化鉴定结果具有差异,因此暂不能确定其分类地位。同时,我们建立了有氧纯培养体系,对其中一株专性需氧菌TGRB4的汞甲基化能力进行了研究。结果发现,在初始Hg²⁺浓度为300ng?l^-1条件下,TGRB4的最大汞甲基化率为1.45%,对数生长期的汞甲基化速率常数为k_m=（8.73±0.64）×10^-12 ng?cell^-1?h^-1,与硫酸盐还原菌Desulfobulbus propionicus strain 1pr3相当。为进一步探讨菌株的汞甲基化能力及其对三峡水库汞循环的贡献,我们设计了一个落干-淹水-再落干的实验来模拟三峡水库消落带周期性干湿交替环境。结果发现,菌株TGRB4在干湿交替过程中仍然表现出汞甲基化能力,且主要发生在第一个落干阶段。土壤MeHg和%MeHg的含量在接入菌株TGRB4的处理（A）中显著高于未接菌的对照处理（B）,表明菌株TGRB4能使土壤汞甲基化。在第一落干阶段,处理A土壤MeHg含量与菌株TGRB4的数量呈显著正相关关系（r²=0.68,p=0.02）,进一步说明本试验条件下的汞甲基化主要是由菌株TGRB4主导的。淹水后,土壤中的MeHg含量随淹水时间的延长而逐渐降低,但水体MeHg则呈现出一种逐渐增高的趋势,说明土壤中的MeHg有向水体迁移的趋势。由于菌株TGRB4分离自三峡水库消落带,因而推测,需氧性微生物对三峡水库落干期土壤MeHg具有一定的贡献,且水库淹水后,会增加水环境中的MeHg风险。不同类型的微生物对汞甲基化过程产生作用的机理也不尽相同。由于菌株TGRB4是一株专性需氧菌,因而其可能存在与厌氧汞甲基化微生物不一样的汞甲基化途径。为揭示有氧条件微生物的汞甲基化途径,我们采用第二代（Illumina Hiseq）和第三代测序（PacBio）相结合的方法对菌株TGBR4进行全基因组测序,并对其进行功能注释。结果发现,菌株TGRB4的基因组序列长度为6.01 Mb,含有5504个基因,79个tRNAs和25个rRNAs。蛋白质功能注释结果表明TGRB4基因组中存在与汞甲基化相关的辅酶,包括5-甲基四氢叶酸和S-腺苷甲硫氨酸。结合KEGG代谢通路注释结果,我们推导出了菌株TGRB4中可能存在的汞甲基化途径:用于MeHg合成的甲基基团是通过5-甲基四氢叶酸或S-腺苷甲硫氨酸,从甲基四氢叶酸上转移而来,而甲基四氢叶酸上的甲基则来源于甲酸盐或者丝氨酸。本研究为后续研究需氧微生物的汞甲基化机制及其在汞的生物地球化学循环中的作用具有重要意义。近年来的研究指出,湿地中的Periphyton（周丛生物）也是一个重要的汞甲基化位点,其在某些湿地生态系统中的汞甲基化潜能甚至超过了底泥。Periphyton是一种藻类、蓝细菌、微生物（包括细菌、真菌、原生动物等）以及细颗粒碎屑等共生的团聚体,其分泌的代谢物不仅能影响汞的生物可利用性,也能作为微生物的营养源,刺进汞甲基化微生物生长,从而促进甲基汞的生成。Everglades是世界上最大的淡水沼泽之一,汞引起的环境问题一直是该区域的研究热点。在该生态系统中,Periphyton作为鱼虾等小型消费者最主要的食物来源,其初级生产量大约占整个生态系统净初级生产量的一半,并且具有很高的汞甲基化潜能,在汞的生物地球化学循环中具有极其重要的作用。目前,大部分研究主要是从生物学角度出发,来揭示Periphyton的高汞甲基化潜能现象,却大大忽略了Periphyton本身特有的环境条件。对于Everglades而言,其表层水体中THg含量在背景范围内,但%MeHg含量远高于其它水体。而Everglades水体本身并不具有汞甲基化能力,那么,水体中的MeHg从何而来?基于Periphyton在该生态系统中的广泛分布及其高汞甲基化潜能,我们采集了Periphyton及其周围不同距离的水体样品,并分析了其THg和MeHg的分布特征。结果发现,距离Periphyton越近,水体THg含量越高,表现为Periphyton间隙水（PPW）>上覆水（POW）>表层水（SW）。在Periphyton胞外聚合物中（EPS）,THg含量在紧密结合的EPS（TB-EPS）中显著高于松散附着的EPS（LB-EPS）,说明在Periphyton微环境中,THg浓度由外到内呈现出增加的趋势。该结果表明Periphyton是水生生态系统重要的无机汞汇。然而,虽然水体MeHg含量的分布特征与THg相似,但%MeHg含量则表现为POW>SW>PPW,说明MeHg具有较高的再分配潜能。此外,MeHg含量在LB-EPS中显著高于TB-EPS,说明MeHg更容易扩散至水体。因此,我们推测Periphyton是水生生态系统重要的甲基汞源。由于Periphyton是一种以其胞外分泌物（EPS）为骨架支撑的三维基质生物膜,且EPS含有大量的官能团,对重金属的形态和迁移转化具有非常重要的作用。因此,我们提取了Periphyton的EPS,包括松散附着的部分（LB-EPS）和紧密粘附的部分（TB-EPS）,用于探究periphyton在汞循环中的作用。结果发现,当向30 ml EPS溶液中加入1.5 ng Hg²⁺并培养24 h后,LB-EPS和TB-EPS中的活性汞（RHg）部分仅占THg的6%和16%,而未添加EPS的超纯水中RHg和THg并不存在显著性差异,我们初步推测EPS与Hg²⁺发生了结合。为进一步验证我们的推测,我们采用分子截留量为3 kDa的超滤离心管,对加入Hg²⁺并培养24 h后的EPS溶液进行超滤分离。结果发现,LB-EPS和TB-EPS中的游离态汞仅占总汞量的9%和8%,而大部分汞被截留在了上层,进一步说明Hg²⁺与EPS发生了结合反应。三维荧光光谱（3D-EEMs）特征显示,LB-EPS和TB-EPS中仅含有一个荧光峰,为类色氨酸蛋白峰。通过荧光猝灭滴定试验发现,EPS主要通过静态猝灭与Hg形成复合物来影响汞的形态和迁移转化,且LB-EPS和TB-EPS中的类色氨酸蛋白基团分别能为Hg²⁺提供0.65和0.54个结合位点,结合常数lgK分别为3.54和2.42。傅里叶红外光谱-衰减全反射（FTIR-ATR）分析表明,蛋白类物质中的酰胺基和硝基官能团是参与LB-EPS与Hg²⁺结合的主要官能团;芳香性胺及醇类是参与TB-EPS与Hg²⁺结合的主要官能团。本研究为后续研究Periphyton及其分泌的EPS在湿地汞的生物地球化学循环中的意义拓展了重要领域。