烟草(Nicotiana tobacum L.)是我国重要的经济作物。在烟草众多的突变体中,叶脉突变体较为罕见。烟草叶脉突变会使烟株叶片形态发生变化,影响烟草的生长发育、产量、品质等。本实验对田间发现的烟草叶脉突变体进行相关研究,通过叶片发育动态观察,叶脉、叶片结构观察,蛋白组表达量分析,常见生理指标测定以及与相关表达差异蛋白所对应的基因的定量分析来初步探究其生理生化指标变化及叶脉突变分子机制,了解此叶脉突变体相关信息。研究结果如下:1.烟草叶脉突变体的表型观察(1)叶脉叶形观察。选择生长状况相同的突变株和野生型烟苗,分别在小十字期、大十字期、四叶期、八叶期观察二者叶片表型性状。突变株发育到八叶期时性状基本稳定,表现为叶脉融合且主脉和侧脉没有明显的区分特征,各级侧脉同主脉在叶原基部分开始分化生长且叶脉弯曲,叶片皱缩展开不完全,叶片表面出现凸起和凹陷形状,叶形为不规则的半圆形或扇形。野生型叶片表型正常。(2)叶脉石蜡切片观察。选取野生型和突变株四叶期和八叶期两个时期的烟株叶脉,分别做石蜡切片,观察叶脉维管束的差异。突变株叶脉维管组织排列疏松,八叶期较四叶期表现更加明显;背轴侧侧脉清晰可见且聚集较紧密。野生型叶脉维管组织排列整齐,背轴侧侧脉界限模糊且排列疏松。(3)叶片扫描电镜观察。在相同视野范围(100um)下突变株较野生型的气孔数量多,野生型为6.3个,突变株为8.3个;突变株气孔较野生型大;叶表皮细胞存在差别,突变株叶表皮细胞界限模糊、形态多变、表面附有较多杂质,野生型叶表皮细胞界限清晰、形态一致、表面光滑干净。(4)叶片亚显微结构观察。突变株和野生型叶脉维管束鞘细胞的细胞壁厚度无明显差异,在细胞形态上突变株表现为不规则形状而野生型表现为类椭圆形,突变株叶片的叶肉细胞中线粒体肿胀程度较野生型轻微而叶绿体中的淀粉粒堆积量较野生型少。2.烟草叶脉突变体生理指标测定通过对烟株八叶期的相关生理指标测定得出以下结论:野生型和突变株中的脯氨酸、MDA、可溶性蛋白和可溶性糖在三个取材阶段均随时间增长而增加但突变株的增量均显著大于野生型;野生型和突变株的生物量随时间增长而增加,野生型的鲜重大于突变株,但突变株的干物质率大于野生型;在光合性能测定中,野生型和突变株的光合色素含量均随时间而增长但突变株高于野生型。各项光合性能指标均随时间增长而增加,突变株均高于野生型。突变株抗氧化能力的SOD、POD、CAT酶活和总抗氧化能力均高于野生型。野生型和突变株叶基部的IAA和CTK含量均高于叶中部和叶尖部;IAA在叶尖部的含量随时间增长而差异越发显著,突变株减少而野生型变化不大;CTK在突变株叶尖部含量有增高趋势,在野生型中无此趋势。3.烟草叶脉突变体差异表达蛋白的iTRAQ分析选取八叶期的野生型和突变株进行蛋白组测定,通过iTRAQ分析总共检测数为232400个,匹配到的光谱数为,44184个,占比为19.0%。鉴定到的多肽(Peptides)的数量为21878个,鉴定到特有肽段序列(UniquePeptide)的个数为14645个,突变株八叶期所取的三个样M1,M2,M3和野生型八叶期所取的三个样W1,W2,W3这六个样所鉴定到的蛋白(Identified proteins)的数量为5593个。可量化的蛋白质的数量为4491个。在差异倍数(S/W Ratio)大于1.5或小于1/1.5的蛋白总共有221个,39个上调蛋白182个下调蛋白,通过GO注释、亚细胞结构注释、KEGG富集分析、蛋白互作分析,筛选出两个差异表达明显且与植株根茎叶发育相关的蛋白A0A1S4CRZ6和P22091,前者参与核糖体蛋白60S大亚基L23的组成后者主要是几丁质酶的组成。对它们所对应的基因LOC107821921和CHN50进行实时荧光定量分析。4.基因CHN50和LOC107821921在突变株和野生型中的相对表达量分析对比基因CHN50和LOC107821921在植株的根、茎和叶片中的相对表达量,可以发现两个基因在茎中的相对表达量最小,在根中的相对表达量次之在叶片中相对表达量最高,且CHN50在突变株中表达量小于野生型,LOC107821921在野生型植株中相对表达量小于突变株,与蛋白检测结果相吻合。