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前言:
人类肿瘤发生的机制是十分复杂的,已经证实恶性肿瘤发生、发展是多基因改变的结果。结直肠癌是人类常见胃肠道肿瘤之一,为多步骤、多阶段、多因素参与的复杂基因病,在我国具有较高的发病率和致死率。特定基因的表达异常在肿瘤中发挥着不同的功能,揭示其在肿瘤发生和演进的具体机制是十分重要的。目前已知,抑癌基因的功能失活、原癌基因的异常激活、基因表达调控异常等均与肿瘤的发生密切相关。
REIC(reduced expression in immortalized cells)是通过RDA系统(represent ative difference analysis system)发现的,由于其在永生化细胞中比相应正常细胞表达降低而得名。研究表明,在恶性肿瘤中REIC可调节肿瘤细胞的增殖和凋亡,对肿瘤具有抑制作用。因此通过检测REIC在结直肠癌组织中表达的临床病理意义及对癌细胞恶性表型的影响,了解REIC在结直肠癌发生和演进过程中的抑癌作用,为结直肠癌早期诊断和靶向治疗提供新的依据。
实验方法:
1、利用免疫组织化学检测结直肠癌中REIC蛋白表达情况,比较其表达与结直肠癌发生、临床病理特征及预后的关系。
2、应用westernblot和real-timePCR检测结直肠癌组织及相应的癌旁非肿瘤黏膜(non-neoplasticmucosa,NNM)组织REIC蛋白和mRNA表达水平。
3、RT-PCR检测结直肠癌细胞中的REICmRNA含量,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测结直肠癌细胞培养液中REIC蛋白的分泌水平。
4、转染pcDNA3.1.REIC质粒入结直肠癌细胞HCT-15和HCT-116,CCK-8(cellcountingkit-8)检测细胞增殖:流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测细胞早期凋亡和线粒体膜电位;Transwell检测细胞迁移和侵袭能力。
5、利用重组REIC蛋(recombinantREIC,rREIC)处理对结直肠癌细胞HCT-15和HCT-116,CCK-8检测细胞增殖;FCM检测细胞早期凋亡和线粒体膜电位;Transwell检测细胞迁移和侵袭能力。
实验结果:
1、结直肠癌中REIC蛋白表达与肿瘤发生、临床病理特征和预后的关系
免疫组织化学检测结果显示结直肠癌癌旁组织、结直肠腺瘤组织、结直肠癌组织及浸润的巨噬细胞的胞浆中存在REIC蛋白表达。REIC蛋白在结直肠癌癌旁组织、结直肠腺瘤组织、结直肠癌组织表达逐渐降低(P＜0.001)。
REIC蛋白的表达与肿瘤的侵袭深度、TNM分期、分化程度、caspase-3的表达和核内生长抑制因子5(ING5)的表达相关(P＜0.05),与患者的年龄、性别以及肿瘤的大小、淋巴侵袭、血管侵袭和淋巴结转移等因素无关(P＞0.05)。
Kaplan-Meier生存曲线分析,显示REIC蛋白表达与结直肠癌患者生存时间无显著相关性(P＞0.05)。Cox风险比例回归模型筛分析显示淋巴侵袭、血管侵袭、淋巴结转移和UICC(Unionfor International Cancer Control)分期是结直肠癌预后的独立危险因素(P＜0.05),而患者年龄、性别、肿瘤大小、侵袭深度、分化程度和REIC蛋白表达不是结肠癌独立的预后风险因素(P＞0.05)。
2、real-timePCR检测结果显示结直肠癌组织中REICmRNA水平明显低于相应的癌旁组织(P＜0.01)。Westernblot检测结果显示结直肠癌及对应癌旁组织中REIC蛋白表达无明显差异(P＞0.05)。
3、结直肠癌细胞中REICmRNA及蛋白分泌水平
REICmRNA在Colo201、DLD-1、HCT-116和HT-29中含量较高,而在Colo205、HCT-15、KM12、SW480、SW620和WiDr中含量较低。所有结直肠癌细胞的REIC蛋白分泌水平均低于300pg/mL。
4、转染pcDNA3.1.REIC质粒对结直肠癌细胞表型的影响
结直肠癌细胞HCT-15和HCT-116转染pcDNA3.1-REIC之后,细胞的增殖能力均显著降低(P＜0.05),细胞线粒体受损,线粒体膜电位降低,细胞凋亡显著增加(P＜0.05),转染处理后细胞的迁移和侵袭能力显著下降(P＜0.05)。
5、rREIC处理对结直肠癌细胞表型的影响
不同浓度rREIC处理后,结直肠癌细胞HCT-15和HCT-116的增殖能力显著下降(P＜0.05),细胞凋亡显著增加(P＜0.05),细胞的迁移和侵袭能力显著下降(P＜0.05)。
结论:
1、REIC表达下调参与结直肠粘膜上皮恶变且与结肠癌侵袭和转移密切相关。
2、细胞浆和分泌型REIC通过抑制增殖、诱导凋亡、降低细胞的迁移和侵袭能力抑制结肠癌的恶性生物学行为及表型。