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大菱鲆、牙鲆是我国重要的海水经济养殖鱼类。近年来,养殖环境的日益恶化导致了养殖病害频发,不但造成了巨大的经济损失,而且还严重制约了相关养殖产业的健康发展。在鱼类对外界刺激及病原物侵袭的防御反应中,非特异性免疫起着重要作用。因此,利用分子生物学及基因工程手段研究鱼类免疫相关基因的功能及其网络调控过程,对于揭示鱼类抗病机理、开发鱼类抗病种质及研发用于鱼类疾病治疗的抗病工程制剂和药物等方面具有重大的理论意义和社会价值。
抗菌肽(AMPs)在鱼体与病原生物不断抗争的过程中起到固有防御的作用。在众多的抗菌肽中,Hepcidin是一种研究的较为详细的小分子抗菌肽,它同时还具有调控细胞中铁离子浓度的作用。NF-kB位于Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)下游信号通路的枢纽位置,当细胞受到病原体刺激后产生应激反应,激活NF-kB,活化的NF-kB进入细胞核调节炎症细胞因子的表达,启动针对病原微生物的固有免疫和获得性免疫。Akirin作为一个NF-kB途径中的新成员已被确定参与此途径。
本文围绕大菱鲆、牙鲆免疫相关基因的功能及其调控网络,以大菱鲆中两个免疫相关基因(SmHepcidin和SmAkirin1)及牙鲆中PoAkirin1基因为研究对象,开展了相关基因的性质与功能的研究。
首先,分别利用RACE技术和基因组步移的方法获得了SmHepcidin的mRNA全长和启动子区序列。序列分析结果表明,该启动子区域含NF-kB转录因子结合位点,双荧光素酶实验结果进一步证明了SmHepcidin可能对NF-kB具有反馈调节作用。此外,外源添加Hepcidin蛋白可以调控细胞中铁离子含量的实验进一步验证了Hepcidin的功能。为明确SmHepcidin的网络调控过程,本研究克隆了SmHepcidin调控相关因子SmFPN1(Ferroportin1)和SmTFR2(Transferrin Receptor2)的全长cDNA序列,并利用荧光实时定量PCR检测细菌或病毒感染以及注射外源Hepcidin蛋白情况下肝、脾、肾组织中SmHepcidin,SmFPN1、SmTFR2的表达变化。结果表明,伴随着SmHepcidin表达量的升高,SmFPN1表达明显降低,SmTFR2表达有所降低或变化不明显。利用RNAi的方法对Hepcidin基因沉默的大菱鲆肾脏细胞中这三个基因的表达模式进行了研究,结果同样证实了上述基因表达规律。通过以上实验结论及前人的研究结果,我们推测SmHepcidin、SmFPN1、SmTFR2三者在调控铁离子平衡过程中起重要作用,同时在大菱鲆抵抗外源病原物过程中,SmHepcidin的表达迅速增加,影响其他相关基因变化,改变细胞中铁离子浓度,从而对外界刺激及病原物侵袭起到防御作用。
其次,我们利用RACE技术获得SmAkirin1基因全长。蛋白预测表明SmAkirin1是一种核蛋白。利用SmAkirin1-GFP及SmAkirin1-m-GFP融合蛋白质粒转染大菱鲆肾脏细胞系,证实了SmAkirin1的核定位信号(NLS)存在于蛋白N末端,虽然该蛋白定位于核内,并参与免疫效应基因的调控,但是自激活实验结果表明SmAkirin1不具有自激活活性,不是一种转录因子。利用荧光实时定量PCR方法检测了细菌或病毒感染后,大菱鲆的肝、脾、肾组织以及大菱鲆肾脏细胞系中SmAkirin1的表达情况,结果表明SmAkirin1的表达受到细菌及病毒诱导。
在与牙鲆免疫相关基因的研究中,我们构建了牙鲆酵母双杂交cDNA文库,该文库的原始库容量为约1.6×106cfu/mL,初级文库甘油保存液滴度约为4.1×104cfu/1.8mL,扩增放大文库库容约为5.00×1010cfu/mL。转化酵母细胞后容量为:5.4x106cfu/mL。从文库中我们发现多种免疫相关基因并克隆到PoAkirin1基因全长。随后使用PoAkirin1作为诱饵筛选与其相互作用的蛋白质:筛选得到49个阳性克隆,获得了7个可能相互作用的基因。从中选择了2个可能与免疫相关或者是蛋白预测后位于细胞核中的蛋白进行了酵母回转验证及分段验证,结果表明,这两个蛋白——PoClq以及PoHEPN能够与PoAkirin1相互结合,其中PoHEPN与PoAkirin1的互作位点可能位于其N末端。通过荧光实时定量PCR检测细菌感染牙鲆的肝、脾、肾组织中PoAkirin1,PoClq以及PoHEPN的表达变化,结果表明这三种基因均受到外源病原物的诱导,通过其响应时间的不同推测它们可能处于免疫信号转导途径的不同位置。最后,构建了PoAkirin1,PoHEPN的原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中进行了原核表达,为进一步验证PoAkirin1与PoHEPN相互作用及揭示其性质与功能奠定了基础。