钩藤碱（rhynchophylline,RIN）和异钩藤碱（isorhynchophylline,IRN）是一对同分异构体,作为传统中药植物钩藤（Uncaria rhynchophylla）中最重要和主要的萜类吲哚生物碱（terpenoid indole alkaloids,TIAs）,它们因为具有强大的神经保护作用和治疗阿尔茨海默症的潜力而受到广泛的关注。与其重要的药理作用相比,钩藤遗传信息却知之甚少,RIN和IRN生物合成途径关键基因仍没有得到鉴定与克隆,这极大的限制了RIN和IRN的开发利用。光是影响植物形态建成和生长发育最重要的环境因子之一,遮光可以增加RIN和IRN的积累水平,但是光调控RIN和IRN生物合成的机制仍不清楚。基于上述问题,本研究以钩藤为材料,探讨了梯度遮光对钩藤形态、生物量以及RIN和IRN含量的影响,通过联合转录组学分析鉴定了RIN和IRN合成途径基因功能,解析了光敏色素互作因子（phytochrome-interacting factor,PIF）和ELONGATED HYPOCOTYL5（HY5）调控RIN和IRN生物合成的机制。取得的主要研究结果如下:（1）比较转录组分析遮光影响钩藤碱和异钩藤碱积累的分子机制通过梯度遮光试验比较了钩藤形态指标、生物量以及RIN和IRN含量的变化。结果表明,遮光改变了钩藤的部分形态指标,但对其生物量没有影响。与不遮光（对照组,CK）相比,重度遮光（heavy shade,HS）后,钩藤叶片中RIN和IRN含量显著增加。对CK和HS样本进行转录组分析,得到79 817个unigenes,平均长度为1 023 bp。值得注意的是,已知参与RIN和IRN生物合成的酶基因,如7-DLGT、8HGO、LAMT、SLS、TDC、STR和SGD,均上调表达,这表明遮光通过诱导其生物合成途径基因上调表达促进RIN和IRN的积累。此外,从转录组鉴定了1 065个推定的转录因子（transcription factors,TFs）,并将其划分为55个TF家族。其中,光信号通路中两个重要的TF HY5和PIFs也存在差异表达。q RT-PCR分析表明,16个差异基因表达水平变化趋势和转录组数据一致,这表明转录组数据是可靠的。（2）全长转录组测序鉴定参与钩藤碱和异钩藤碱合成的候选基因采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）和联合测序平台探索了RIN和IRN生物合成、积累和转录组。结果表明钩藤不同器官中RIN和IRN及其前体色胺和裂环马钱子苷的积累有差异:RIN和IRN主要在叶和茎中积累,根中含量极低;色胺和裂环马钱子苷在不同器官中均有分布,色胺在根中含量最高,裂环马钱子苷在叶中含量最高。结合Illumina RNA-Seq和单分子实时测序（single-molecule real-time,SMRT）技术解析钩藤全长转录本,基于联合测序共生成93 338个转录本,其N50为2 991 bp。还预测了4 013个lnc RNA和3 762个推定的TFs。更重要的是,转录组注释了156个转录本编码可能参与RIN和IRN生物合成的酶,RNA-Seq数据显示,其中有67个转录本在不同器官中有差异表达,上游途径基因在根中表达水平高于叶和茎,下游的SGD基因在叶中的表达水平高于根和茎。这表明RIN和IRN在钩藤全株均有合成,同时也暗示RIN和IRN和/或其前体物质可能存在组织间的运输。进一步从转录组中发现了2个ABC转运蛋白和7个MATE转运蛋白,它们与已知的生物碱转运蛋白有较近的进化关系,可能与RIN和IRN和/或其前体物质在钩藤中的转运有关。（3）光响应钩藤碱和异钩藤碱合成途径候选基因表达分析通过转录组比较分析,鉴定了12个光响应钩藤碱和异钩藤碱合成途径候选基因的全长转录本,进一步的遮光与复光实验表明,Ur8HGO、UrSTR1和UrSGD1表达模式与RIN和IRN积累是一致的。通过病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技术鉴定了UrSTR1和UrSGD1的功能,结果表明基于TRV体系的VIGS技术是钩藤基因功能鉴定的有效方法。UrSTR1和UrSGD1沉默植株中RIN和IRN含量显著下降,这表明UrSTR1和UrSGD1参与了RIN和IRN的生物合成。（4）钩藤UrPIF3参与光调控钩藤碱和异钩藤碱的生物合成PIFs是具有基本螺旋-环-螺旋（b HLH）结构域的转录因子,它们与光敏色素相互作用,在光信号转导过程发挥重要作用。从钩藤转录组中鉴定了一个b HLH转录因子UrPIF3,该基因在遮光过程中上调表达,在复光过程中下调表达。亚细胞定位结果显示其编码蛋白定位于细胞核。VIGS实验证实沉默UrPIF3导致UrSTR1和UrSGD1表达下调,RIN和IRN在叶中积累减少。这表明UrPIF3参与了光调控RIN和IRN的生物合成。通过FPNI-PCR技术,分别克隆了UrSTR1和UrSGD1基因上游1 344 bp和1 576 bp的启动子序列,而且两个启动子序列中均包含有光响应元件G-box元件。酵母单杂交实验证明UrPIF3直接与UrSGD1的启动子结合,但不与UrSTR1的启动子结合。双荧光素酶分析表明,UrPIF3能够显著增强UrSGD1的启动子活性,表明UrPIF3正调控RIN和IRN生物合成。（5）钩藤UrHY5参与光调控钩藤碱和异钩藤碱的生物合成HY5属于basic Leucine Zipper（b ZIP）转录因子家族成员,是光信号转录调控网络的枢纽。在本研究中,从钩藤转录组中鉴定了一个UrHY5转录因子,该基因在遮光过程中下调表达,在复光过程中上调表达。亚细胞定位结果显示其编码蛋白也定位于细胞核。VIGS试验表明,UrHY5沉默后,UrSTR1和UrSGD1在转录水平上显著上调,钩藤叶中RIN和IRN的积累显著提高。酵母单杂交实验证明UrHY5能够直接与UrSTR1和UrSGD1的启动子结合。双荧光素酶分析表明,UrHY5能够显著抑制UrSTR1和UrSGD1的启动子活性,表明UrHY5负调控RIN和IRN生物合成。本研究基于比较转录组分析,鉴定了光响应RIN和IRN生物合成途径基因和光信号转导途径转录因子。通过VIGS技术鉴定了UrPIF3、UrHY5、UrSTR1和UrSGD1基因功能,酵母单杂交和双荧光素酶试验证实UrPIF3能够激活UrSGD1的表达;UrHY5能够抑制UrSTR1和UrSGD1的表达。