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微生物中,非编码RNA(ncRNA或sRNA)是一类长度介于40-500个核苷酸且不编码蛋白的RNA分子。近来发现非编码RNA在原核生物物质代谢、环境适应、群体感应及宿主侵染等过程中发挥重要调控功能。根际固氮菌中的非编码RNA研究较少,集中于保守的基础代谢、逆境适应、固氮特殊形态(蓝藻异型胞分化及根瘤菌结瘤)的形成等过程。关于非编码RNA是否直接参与生物固氮及其调控过程未见报道。固氮施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri A1501)是一株分离自我国南方水稻根际土壤中的具有固氮、促生和耐盐等优良特性的联合固氮模式菌。为明确非编码RNA是否参与固氮施氏假单胞菌的固氮调控过程,采用转录组分析、突变株构建、蛋白质组学及大分子互作技术,鉴定了一个特异响应铵信号,并参与固氮酶活性调控的非编码RNAArsZ。取得的主要研究结果如下：(1)运用Illumina (Solexa)高通量测序技术测定了A1501菌在固氮和铵抑制两个不同条件下的转录组,发现了53个非编码RNAs。与铵抑制条件相比,有17个非编码RNAs在固氮条件下表达上调,有6个显著下调。对一个长度仅54个核苷酸且在固氮条件下诱导上调达23倍的非编码RNA进行了重点分析。由于该小RNA能特异响应外界环境的铵信号,故将其命名为铵响应小RNAArsZ (Ammonium-Responsive Small RNA)。序列比对显示ArsZ为一个全新的非编码RNA,具有种特异性。通过Northern杂交鉴定了该小RNA的存在,通过5’RACE实验明确了其转录方向和转录起始位点。qRT-PCR实验表明ArsZ在氮限制条件下诱导表达,而且依赖于氮代谢调控节点蛋白NtrC和RpoN (δ54),进一步通过凝胶阻滞和DNase I足迹法证明该小RNA的转录表达直接受激活蛋白NtrC和σ因子RpoN协同调控,预示其在氮代谢调控中可能发挥作用；(2)构建了ArsZ缺失突变株△arsZ及互补菌株,固氮酶活测定表明△arsZ固氮酶活性下降52%。qRT-PCR发现突变株中固氮调控基因nifA和结构基因nifHDK均显著下调,表明ArsZ参与了生物固氮调控；此外,也发现ArsZ突变对菌体的氧化、渗透及盐胁迫抵抗能力以及趋化运动能力均有显著影响,说明其在逆境胁迫适应中发挥重要作用；(3)为明确ArsZ参与固氮基因表达调控的模式和靶标,开展了固氮条件下缺失突变ArsZ和野生型A1501的蛋白组学分析。结果发现：缺失突变ArsZ后,固氮酶钼铁蛋白NifDK表达量显著下调。RNA结构预测发现,ArsZ二级结构中C1-G24茎-环区段与nifD、nifK的mRNA中存在可能的互补配对位点,预示nifD、nifK的mRNA可能是ArsZ的调控靶标。对C1-G24茎-环区段几个关键配对位点分别进行总体替换和定点突变并回补△arsZ,固氮酶活数据表明ArsZ的G1sG16位点对ArsZ的调控功能起关键作用。mRNA半衰期测定表明,ArsZ的缺失影响了nifD mRNA稳定性。进一步采用微量热泳动技术(MST)证实了ArsZ与nifD的mRNA存在相互作用。综上所述,ArsZ是一个铵限制条件下诱导、固氮条件下高表达的具有调控功能的非编码RNA,可通过与靶标mRNA直接互作的方式增强固氮酶结构基因mRNA的稳定性或通过某种机制增强菌体对外界氧化及渗透胁迫抗性,进而有助于实现A1501菌的最佳固氮酶活。