论文部分内容阅读
光呼吸是绿色植物在有光的条件下吸收氧气并且释放出二氧化碳的代谢过程。该代谢过程十分复杂,涉及到叶绿体、过氧化物酶体、线粒体以及细胞质,其代谢的总结果是生成了一分子的二氧化碳和一分子磷酸甘油酸。在整个光呼吸代谢途径中,乙醇酸在乙醇酸氧化酶（gylcolate oxidase,GOX）的作用下生成了乙醛酸,同时也产生了H2O2,然而积累过多的H2O2会导致部分细胞死亡。特别是在高光、干旱等光呼吸增强的条件下,植物细胞会产生大量活性氧（ROS）,一旦活性氧水平升高,将不利于植物的生长发育。目前尚不完全清楚植物通过何种机制降低氧化水平而免受伤害。已知超氧化物歧化酶SOD属于一种含金属的抗氧化酶,普遍存在于生物体中,根据SOD酶活中心结合金属原子的不同,可以分为Mn SOD、Fe SOD、Cu/Zn SOD和Ni SOD等4种类型。SOD是重要的抗氧化酶系之一,但对其是否在清除光合、光呼吸氧化中发挥作用未见报道。本研究从EMS诱变的拟南芥野生型Col-0的突变体库中筛选到了一株可稳定遗传的突变体,该突变体在大气下具有叶片呈黄色、植株矮小等表型,而在3000 ppm CO2下的表型与野生型Col-0一致,图位克隆表明该突变体是由At FSD3（At5g23310）发生点突变所致。本文以该突变体作为研究材料,获得了以下的研究结果:1.突变体27-24的获得我们通过对27号突变体库（EMS诱变Col-0）进行筛选,最终得到了一株能稳定遗传的黄色叶片突变体,我们将该突变体命名为27-24。在大气中生长的突变体一部分能抽台开花,但植株的枝条十分纤细、矮小,整个植株的叶片呈黄化状态,果荚短小,种子数量少,而在3000 ppm CO2下生长的突变体表型与野生型Col-0一致。2.突变体27-24生理指标的测定以大气下和高CO2下生长的突变体27-24和野生型Col-0为材料,利用丙酮和无水乙醇提取叶绿素,并在663 nm和645 nm波长下进行测定,同时也用SPAD仪对叶片进行叶绿素相对含量的测定,结果发现,在大气下生长的突变体的叶绿素含量与野生型相比差异显著,而在高CO2下生长的突变体的叶绿素含量与野生型并无明显差异。同时利用叶绿素荧光成像仪测叶片的最大光化学效率Fv/Fm,结果与叶绿素含量测定的结果相吻合。随后我们用大气下和高CO2下生长5周的野生型和突变体作为材料,对其进行莲座叶片数和平均叶片重量的统计,结果表明,在大气下生长的突变体的莲座叶片数和叶片平均重量,都明显低于野生型,而在高CO2下生长的突变体的莲座叶片数和叶片平均重量,都接近于野生型。同时对大气下和高CO2下生长的野生型和突变体进行了NBT染色和DAB染色,用来检测植物体内ROS水平。最终发现,大气下生长的突变体叶片积累的ROS水平要明显的高于野生型;而在高CO2下生长的突变体叶片积累的ROS水平接近于野生型。3.突变基因的定位将突变体27-24和野生型Ler进行杂交,构建图位克隆的群体,并用拟南芥染色体上均匀分布的24对Marker引物进行扩增。首先将该突变基因初步定位在5号染色体的5.44 M13.58 M之间,然后重新设计引物进行基因精细定位,最后将该突变基因定位在5号染色体的6.61 M8.60 M之间,随即将该突变体送到公司进行基因组重测序,结合在6.61M8.60M之间发生的SNP突变及突变体表型分析,初步确定该突变体的表型是由At5g23310基因发生突变所致,即该基因c DNA序列中的第748位碱基由G变为A,导致FSD3蛋白中Glu250转变为Lys250。4.互补实验验证突变基因结合基因组重测序以及突变体27-24在大气下具有叶片呈黄色、植株矮小等表型,通过搜索文献,最终发现该突变体的表型与超氧化物歧化酶突变的表型一致,从Tair网（https://www.arabidopsis.org/）下载At5g23310的基因序列,选取该基因的上游启动子序列以及该基因的全长序列来构建它的互补载体,利用浸花法侵染该突变体,经庆大霉素筛选,最终得到了与野生型表型一致的互补植株。根据候选基因At FSD3重新设计特异性引物,构建过表达载体,利用浸花法侵染该突变体,经庆大霉素筛选,最终得到了几株阳性株系。随后对互补植株和过表达植株进行叶绿素含量和最大光化学效率Fv/Fm的测定,结果表明两者的叶绿素含量和Fv/Fm值都接近于野生型Col-0。最终确定突变体27-24的黄化、矮小等表型是由At FSD3基因突变造成的。5.突变基因在拟南芥中的表达分析通过游离过表达植株的原生质体,并利用显微激光共聚焦进行荧光观察,结果表明At FSD3基因定位在叶绿体上。同时构建GUS表达载体,将生长5周的T1代阳性苗进行GUS染色,最终发现T1代阳性苗的叶片、果荚以及花瓣都没有染上色,只有花粉粒才染上了蓝色。随后再种植一代,对T2代的幼苗进行GUS染色,结果发现T2代幼苗的子叶都染上了蓝色。