1997年,英国科学家Wilmut首次报道了克隆羊“多莉”(Dolly)的诞生,开创了以体细胞为核供体克隆动物的先例。证明了来自于成年动物的体细胞的细胞核与去核的卵母细胞融合后,可以得到克隆动物,体细胞核经重编程后具有发育的全能性。而胚胎成纤维细胞具有易分离、易培养、传代次数较多、体外培养时间长、核型较稳定等优点,可以满足筛选时体外培养时间长的要求,是目前最常用的用于基因打靶实验的供体细胞。本实验选用37天猪胚胎为材料,采用胶原酶消化的方法,分离原代成纤维细胞,用于基因打靶实验。将线性化的基因敲除载体,经脂质体LipofectamineTM2000介导,转染原代成纤维细胞。经G418筛选5-7天,GANC筛选10天获得双抗性细胞。抗性细胞经扩大培养后,部分冻存,部分用于鉴定。对筛选到的抗性细胞进行了PCR鉴定、Southern杂交鉴定,初步确定筛选到的细胞为基因敲除细胞,同时对细胞进行了核型分析和性别鉴定,然后阳性细胞用于核移植。供体细胞与去核的卵母细胞融合后,在体外可以发育至囊胚,囊胚的发育成活率在87%左右。