五节芒次生壁合成调控转录因子SWN1的克隆及功能分析

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植物次生细胞壁是木质纤维素的主要来源,是自然界中储量最大、来源最丰富、分布最广的可再生生物质资源,是生物燃料、新型生物基材料以及化学品制造等生产中可再生糖和酚类等化合物的重要来源,具有重要的经济价值和应用价值。而在实际的工业生产和大规模应用中,由于植物细胞壁形成的天然抗降解屏障造成对木质纤维素原料的预处理、解聚、发酵等重要环节成本高昂、效率低下,并且在酶解过程中使用的化学试剂不符合绿色经济的环保理念。因此,通过揭示纤维素类生物质作物次生壁的合成调控路径,利用基因工程手段对木质纤维素生物质原料进行改造,可以创制优良、稳定的种质资源,为下游能源和材料产业提供优质的生物质原料,提高生物质在生化生产和生物燃料制备中的利用效率。五节芒(Miscanthus.floridulus)是芒属植物中具有代表性的一个种,在芒属植物中生物质产量位居首位,并且纤维素含量、纤维素结晶度和纤维素聚合度等生物质品质特性优异,已成为全球热门的能源和材料研究对象。因此,了解五节芒次生细胞壁的交联方式和木质纤维素的合成转录调控路径,探究其形成和降解机理,以及对木质纤维素的结构组成和降解效率的影响,具有重要的经济价值和科学意义,以期为后续通过现代科学手段获取优质、稳定的五节芒生物质原料提供理论基础。为此,本研究在五节芒中克隆出了水稻Os SWN1的同源基因,命名为Mf SWN1,通过生物信息学对其核酸和蛋白序列以及基础理化性质进行分析发现,五节芒Mf SWN1基因编码蛋白具有明显的NAC结构域,并且多序列比对和进化树分析显示其与甘蔗、高粱等SWN1蛋白具有高度同源性。为了进一步研究Mf SWN1基因的超量表达对植物次生壁结构的修饰功能,本研究获得了Mf SWN1基因过表达转基因拟南芥。在拟南芥中,表型观察和细胞组织观察显示,Mf SWN1-OX拟南芥莲座叶增大皱缩并且抽薹延后,但相较于野生型拟南芥Col-0最终平均株高和茎径极显著增加,并且伴随出现了明显的角果弯曲表型。5周龄Mf SWN1基因过表达拟南芥茎的横切相较于野生型拟南芥间苯三酚染色着色较浅,木质素自发荧光强度降低,但维管束和维管形成层面积增大,导管分子和筛管细胞的大小增大。除此之外,通过卡尔科弗卢荧光增白剂对Mf SWN1过表达拟南芥的茎纤维素进行染色,在髓部、维管束和维管形成层区域都具有更强的荧光强度。通过荧光定量PCR对次生壁合成通路中的相关转录因子基因和酶基因进行相对表达量的测定,研究表明Mf SWN1基因在拟南芥中异位过表达导致纤维素生物合成关键基因At Ces A4、木质素聚合关键基因At LAC4和At4CL1以及半纤维素生物合成相关基因At IRX7和At IRX8都出现了极显著上升,但是At CCo AOMT1基因表达量出现了极显著的下降,At Ces A7基因表达量没有明显变化。说明五节芒Mf SWN1基因参与了植物次生壁的生物合成调控,能显著上调了部分纤维素、木聚糖和木质素的生物合成相关的关键酶基因的表达。进一步对Mf SWN1过表达拟南芥植株的细胞壁主要成分进行了研究。研究表明,8周龄Mf SWN1-OX转基因拟南芥中纤维素、半纤维素和木质素含量都出现了升高,果胶含量下降,并且木糖的含量极显著升高,Xyl/Ara的比值也出现了极显著的升高。对木质纤维素结构特性进行分析表明,Mf SWN1过表达植株相比于野生型植株纤维素的结晶度和聚合度显著升高,生物质的酶解产糖效率分析显著降低。综上,本研究克隆出水稻Os SWN1的同源基因Mf SWN1,并通过研究表明Mf SWN1是五节芒次生细胞壁发育过程中的关键调控因子,可以通过调控植物纤维素、半纤维素和木质素的生物合成,调节植物次生壁的生物合成,最终影响生物质的纤维素结构特征和酶解产糖效率。期望通过后期对该基因功能的进一步挖掘和利用,从木质生物质原料本身入手,通过基因改良的手段创制优良、稳定的种质资源,为下游能源和材料产业提供了一条绿色、低成本降解转化的新途径和新策略。
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