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骨骼肌是胰岛素介导葡萄糖摄取的最主要部位,全身大约80%的葡萄糖代谢发生在骨骼肌组织中。胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）是指胰岛素介导的靶器官对胰岛素作用的敏感性降低,主要发生在骨骼肌、脂肪和肝脏组织中。研究表明氧化应激和炎症反应是导致IR的重要因素。氧化应激能够激活核因子Kappa-B（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路,抑制胰岛素介导的胰岛素受体（insulin receptor,Ins R）和胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1,IRS1）的酪氨酸磷酸化,导致胰岛素信号失活;炎症反应能够激活c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路,干扰胰岛素信号的传导,抑制葡萄糖转运进而发生IR。骨化三醇（1,25-Dihydroxycholecalciferol,1,25（OH）2D3）是维生素D的活性形式,可抑制体内活性氧（reactive oxygen,ROS）的产生并下调NF-κB的表达,通过IRS1/GLUT4级联反应改善糖尿病模型中的葡萄糖代谢;还可以调节PI3K/IRS1通路,改善IR。黄芪多糖（astragalus polysaccharide,APS）是从黄芪干燥根中提取的一类大分子活性物质,能够降低糖尿病大鼠模型体内的氧化应激水平,增加葡萄糖转运蛋白（glucose transporter,GLUT）的表达,使胰岛素受体底物（insulin receptor substrate,IRS）数目显著上调,减轻IR。目的:明确1,25（OH）2D3联合黄芪多糖对骨骼肌细胞胰岛素抵抗的缓解作用,并探讨其作用机制,为缓解胰岛素抵抗提供科学依据。方法:采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基体外培养L6成肌细胞,长至70%～80%时,采用含2%胎牛血清的高糖DMEM培养基诱导其分化为骨骼肌细胞。给予不同浓度APS和1,25（OH）2D3处理,采用CCK-8法检测细胞存活率,己糖激酶法测定细胞上清葡萄糖含量,确定本研究APS和1,25（OH）2D3的处理浓度。利用棕榈酸（palmitic acid,PA）建立骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型。实验分为5组:Control组、PA组（0.4m M PA作用24h）、PA+APS组（0.4m M PA作用24h+100μg/ml APS处理24h）、PA+1,25（OH）2D3组（0.4m M PA作用24h+100n M 1,25（OH）2D3处理24h）、PA+APS+1,25（OH）2D3组（0.4m M PA作用24h+100μg/ml APS和100n M 1,25（OH）2D3处理24h）。采用ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-6、IL-10、MCP-1、TNF-α和APN的浓度;采用流式细胞术检测各组细胞内ROS水平;采用Western Blot法检测胰岛素信号传导通路相关蛋白（IR、IRS-1、p-IRS-1、GLUT4）、PI3K通路相关蛋白（PI3K、PKCε、PDK1）、NF-κB通路相关蛋白（P65、p-P65、p38MAPK、TLR4）和脂肪细胞膜相关蛋白（adipocyte membrane associated proteins,APMAP）的表达。利用IBM SPSS 24.0统计软件进行数据统计分析。计量资料用（?）±s表示。采用方差分析（One Way ANOVA）法进行多组间的比较,LSD法（Least-significant Difference Test）进行组间两两比较。检验标准设定为α=0.05。结果:1.L6骨骼肌细胞诱导分化成功的鉴定L6细胞排列不规则,没有肌型结构,细胞界限不清,多数呈椭圆形、多角形等形态;诱导分化4d可见细胞逐渐形成肌型结构,排列规则,呈长梭形,诱导7d后细胞融合形成较多明显的肌管。2.胰岛素抵抗模型的建立随着PA作用时间和浓度增加,细胞存活率逐渐下降,细胞上清葡萄糖含量逐渐增加。本实验确定0.4 mmol/L为PA造模浓度,24h为造模时间。3.黄芪多糖浓度的确定随着APS浓度的增加,细胞存活率和葡萄糖摄取能力逐渐增强。本实验选择100μg/ml为APS处理浓度。4.1,25（OH）2D3浓度的确定随着1,25（OH）2D3浓度的增加,细胞存活率和葡萄糖摄取能力逐渐增强。本实验选择100n M为1,25（OH）2D3处理浓度。5.细胞上清炎性因子的分泌水平与Control组比较,其他各组细胞上清中TNF-α水平均显著升高,IL-10水平均显著降低（P＜0.05）;PA组细胞IL-6、MCP-1水平和PA+1,25（OH）2D3组IL-6水平显著升高（P＜0.05）,PA组和PA+APS+1,25（OH）2D3组APN水平显著降低（P＜0.05）。与PA组比较,PA+APS、PA+1,25（OH）2D3和PA+APS+1,25（OH）2D3组细胞IL-6、MCP-1、TNF-α水平显著降低,IL-10、APN水平显著升高（P＜0.05）。PA+APS+1,25（OH）2D3组IL-6水平显著低于PA+1,25（OH）2D3组,IL-10水平显著高于PA+APS和PA+1,25（OH）2D3组（P＜0.05）。6.细胞内活性氧的产生水平与Control组比较,其他各组细胞内ROS水平均显著升高（P＜0.05）;与PA组比较,PA+APS、PA+1,25（OH）2D3和PA+APS+1,25（OH）2D3组内ROS水平均显著降低（P＜0.05）。PA+APS+1,25（OH）2D3组细胞内ROS水平显著低于PA+APS和PA+1,25（OH）2D3组（P＜0.05）。7.胰岛素信号传导通路相关蛋白的表达水平与Control组比较,PA、PA+APS组IR、IRS-1蛋白表达水平和PA组、PA+APS、PA+1,25（OH）2D3、PA+APS+1,25（OH）2D3组p-IRS-1、GLUT4蛋白表达水平以及p-IRS-1/IRS-1比值均显著降低（P＜0.05）。与PA组比较,PA+1,25（OH）2D3、PA+APS+1,25（OH）2D3组的IR和PA+APS、PA+1,25（OH）2D3、PA+APS+1,25（OH）2D3组IRS-1、p-IRS-1、GLUT4蛋白表达水平以及p-IRS-1/IRS-1比值均显著升高（P＜0.05）。PA+APS+1,25（OH）2D3组的IR、IRS-1、p-IRS-1、GLUT4蛋白表达水平均显著高于PA+APS和PA+1,25（OH）2D3组（P＜0.05）。8.PI3K通路相关蛋白的表达水平与Control组比较,PA组PI3K、PDK1蛋白表达水平、PA+APS和PA+1,25（OH）2D3组PI3K、PKCε蛋白表达水平和PA+APS+1,25（OH）2D3组PKCε蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）,PA组PKCε蛋白表达水平、PA+APS和PA+1,25（OH）2D3组PDK1蛋白表达水平和PA+APS+1,25（OH）2D3组PI3K、PDK1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。与PA组比较,PA+APS、PA+1,25（OH）2D3、PA+APS+1,25（OH）2D3组PDK1蛋白表达水平、PA+1,25（OH）2D3和PA+APS+1,25（OH）2D3组PI3K蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）,PA+APS、PA+1,25（OH）2D3和PA+APS+1,25（OH）2D3组PKCε蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。PA+APS+1,25（OH）2D3组的PI3K蛋白表达水平显著高于PA+APS和PA+1,25（OH）2D3组（P＜0.05）,PDK1蛋白表达水平显著高于PA+APS组（P＜0.05）,PKCε蛋白表达水平显著低于PA+APS组（P＜0.05）。9.氧化应激通路相关蛋白的表达水平与Control组比较,PA组P65、p-P65、p38MAPK、TLR4蛋白表达水平以及p-P65/P65的比值、PA+APS组P65、p-P65、p38MAPK、TLR4蛋白表达水平、PA+1,25（OH）2D3组P65、p38MAPK蛋白表达水平以及p-P65/P65的比值均显著升高（P＜0.05）,PA+APS+1,25（OH）2D3组p-P65/P65的比值显著降低（P＜0.05）。与PA组比较,PA+APS、PA+1,25（OH）2D3和PA+APS+1,25（OH）2D3组P65、p-P65、p38MAPK、TLR4蛋白表达水平以及p-P65/P65的比值显著降低（P＜0.05）。PA+APS+1,25（OH）2D3组p-P65、p38MAPK蛋白表达水平以及p-P65/P65的比值均显著低于PA+APS和PA+1,25（OH）2D3组（P＜0.05）,TLR4蛋白表达水平显著低于PA+APS组（P＜0.05）。10.脂肪细胞膜相关蛋白APMAP表达水平与Control组比较,PA、PA+APS和PA+1,25（OH）2D3组APMAP蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与PA组比较,PA+APS+1,25（OH）2D3组APMAP蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。PA+APS+1,25（OH）2D3组APMAP蛋白表达水平显著高于PA+APS和PA+1,25（OH）2D3组（P＜0.05）。结论:1.PA可以降低骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力,激活氧化应激通路和炎症反应,诱导细胞出现胰岛素抵抗。2.1,25（OH）2D3和APS能够提高胰岛素抵抗骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力,抑制氧化应激通路相关蛋白的表达,抑制炎性因子的释放,且联合使用优于单独使用。3.1,25（OH）2D3和APS可以通过上调APMAP蛋白的表达缓解骨骼肌细胞的胰岛素抵抗,且联合作用优于单独作用。