论文分别采用人工化学改造和基因重组改造技术手段,分别对血红蛋白和松驰素受体蛋白这两类功能性蛋白进行结构改造,以获得更适于研究和应用需求的人工改造蛋白。血液资源紧缺和血源性污染等问题促使人们研究和开发血液代用品,其中以血红蛋白为基础的血液代用品备受关注。动物血资源丰富、价廉且易于避免和控制污染,是代血物的首选原料。多年来国内外研究主要集中在牛血红蛋白为基础的血液代用品。而猪血在我国来源广泛,取材容易,价格低廉,且其结构和性能与人血红蛋白十分接近,免疫原性低,氧亲和调节机制与人血红蛋白相同,是人血红蛋白的理想替代物。本论文选择猪血为原料经分离纯化制备无基质猪血红蛋白,利用多种化学修饰手段改造猪血红蛋白,并对修饰产物的结构、携氧性能等进行了研究。针对脱离红细胞后的血红蛋白容易解聚和氧亲和力过高等问题,采用氧化棉子糖、双3,5二溴水杨酸延胡索酸酯(DBBF)等小分子化合物对猪血红蛋白进行人工修饰。SDS-PAGE分析表明,经小分子修饰后的血红蛋白都发生了亚基间的共价交联。在脱氧状态下,氧化开环棉子糖修饰后的猪血红蛋白的半饱和氧分压(Pso值)为2.93kPa,希尔系数为2.1；氧解离曲线较未经修饰的猪血红蛋白明显右移,有利于调整修饰产物的携氧能力。在脱氧条件下经DBBF修饰,猪血红蛋白携氧能力得到改善。在反应混合物中加入IHP,产物的Pso明显升高。对DBBF修饰血红蛋白的反应条件进行分析,发现当两者摩尔浓度比为2：1,反应时间2小时,产物的Pso值为3.07kPa,希尔系数为2.2。聚乙二醇修饰蛋白可以增加蛋白分子量,延长其在体内循环时间,还可钝化其免疫原性。采用4种不同方法活化PEG并对猪血红蛋白进行修饰,比较了它们的修饰效率、修饰产物的携氧功能和稳定性等。进一步考察采用PEG和DBBF联合修饰猪血红蛋白的效应。结果证明联合修饰产物具有稳定的四聚体结构,半饱和氧分压Pso在3.33kPa左右,接近于生理条件下人体红细胞的Pso值。通过检测人工修饰产物对家兔的免疫原性,及静脉输注修饰产物对家兔肾、肝、心脏等重要脏器的影响,初步评价了人工改造猪血红蛋白的生物安全性。松弛素家族肽不仅是影响受精、着床、妊娠、分娩、哺乳的重要生殖激素,它还对维持心脏、血管、肾脏和脑的功能起重要作用,它可能还与某些肿瘤的发生有关。全面阐明这类激素的生物学功能及其作用机理对相关疾病的治疗和药物开发具有极其重要的意义。通过基因克隆手段表达激素受体是研究受体-配体作用机制和筛选相应药物的新思路。通过基因重组手段对松弛素受体蛋白进行改造：将松弛素家族肽受体1(RXFP1)或松弛素家族肽受体2(RXFP2)的胞外域与T细胞表面抗原CD8的基因片段重组装入质粒pcDNA3.1/zeo,后者转染HEK293T细胞,通过筛选培养获得RXFP1胞外域(即7BP)和CD8融合蛋白的表达细胞株,以及(RXFP2)胞外域(即8BP)和CD8融合蛋白的表达细胞株。经放射性配体结合试验表明,7BP转染细胞表面具有与H2和H3松弛素高度亲和的结合位点,与报道的RXFP1特征相似；而8BP转染细胞表面呈现与胰岛素样肽-3(INSL3)高度亲和的结合位点,它与H2松弛素也有较高的亲和性,但几乎不结合H3松弛素,这些都符合RXFP2的特征。以上结果表明,两种受体胞外域都已正确锚定在转染细胞表面。在受体蛋白胞外域的N端设计FLAG标签,在胞外域蛋白与T细胞表面抗原CD8跨膜域之间设计凝血酶切割位点。稳态转染细胞在含5 IU/ml凝血酶的无血清培养基中培养3天后,可从培养液中获得从细胞表面酶切下的7BP或8BP蛋白。通过Ni螯合Sepharose和FLAG亲合色谱分离纯化,获得纯7BP或8BP蛋白。33P-释放素的交联实验表明,可溶性纯7BP保留结合松驰素的性能。纯化的7BP蛋白能特异性抑制由松驰素引发细胞内cAMP水平上升的现象。这表明7BP是良好的RXFP1的功能拮抗物。利用7BP蛋白的FLAG亲和末端,将7BP固定在蛋白芯片表面,以固定化7BP蛋白芯片和SELDI-MS分析技术为基础,初步建立了一个可筛选特异性配体的BP蛋白芯片分析系统。