日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)属于黄病毒科黄病毒属,能够引起人的中枢神经系统损伤和猪的繁殖障碍等疾病,在自然界中主要是通过蚊虫叮咬进行传播,蚊子是病毒的传播宿主,水禽和猪是病毒主要的扩增宿主。根据病毒E基因序列可将JEV分为五个基因型,即基因I、II、III、IV、V型(GI、II、III、IV、V)。从上世纪30年代到20世纪末,GⅢ型毒株一直占据着亚洲地区JEV流行的主要地位,但最近二十年GⅠ型JEV逐渐替代GⅢ型成为我国乃至整个亚洲地区的主要流行毒株,而对于基因型转换的分子机制目前尚不清楚。最近研究发现,GⅠ型JEV相对于GⅢ型在水禽宿主中具有适应性的优势,能够引起雏鸭产生滴度更高、持续时间更长的病毒血症,而宿主适应性的差异被认为可能是引起JEV基因型转换的一个重要的原因。为解析GⅠ型与GⅢ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子基础,本研究首先建立了GⅠ型与GⅢ型JEV PCR-Based反向遗传学系统。GⅠ型与GⅢ型JEV基因组全序列的同源性约为88.9%,存在12.3%的差异性,而基因组序列间的差异,限制了酶切位点的选择,为后期GⅠ型与GⅢ型JEV间嵌合病毒的构建带来了困难。为解决这一困难,我们根据GⅠ型与GⅢ型JEV基因组间的保守序列,设计了四对通用型引物,以GⅠ型毒株SH7与GⅢ型毒株SH15的cDNA为模板,分四段扩增出涵盖病毒基因组全长的DNA片段,并在第一段的5’端引入一T7启动子序列,随后将四个片段克隆在低拷贝质粒POK-12上。以构建的低拷贝质粒为模板,扩增出各自的四个片段,随后利用特异的通用型引物,通过两轮Fusion PCR方法分别获得了含有T7启动子序列的GⅠ型与GⅢ型病毒基因组的全长DNA序列,经体外转录并转染BHK细胞,拯救出了病毒粒子rGI与rGIII。经鉴定拯救出的病毒粒子与亲本毒具有相似的复制特性,且在BHK上能够形成大小、形态相似的病毒蚀斑。GI/Ⅲ型JEV PCR-Based反向遗传学系统具有很好的稳定性且易于操作,这为下一步嵌合病毒与定点突变病毒的构建提供了关键性的技术平台。在研究初期发现GⅠ型毒株SH7与SD12相对于GⅢ型毒株SH15与SH19在水禽宿主细胞DEF中能够诱导更低水平IFN-α与IFN-β的表达,使得SH7与SD12毒株在DEF中能够达到更高的病毒复制滴度,并且在雏鸭动物实验中也发现攻毒GI-SH7的雏鸭组相对于攻毒GIII-SH15组,其血清中IFN-α与IFN-β的含量更低,且其病毒血症的滴度更高、持续的时间也更长。但是,这种诱导Ⅰ型干扰素表达差异的现象具有宿主特异性,仅在禽类宿主中发现,而在其他两类宿主细胞ST与bEnd.3中并没有发现诱导IFN-α与IFN-β表达的差异,且不存在病毒复制上的差异,因此GⅠ型与GⅢ型JEV在水禽宿主中特异性的诱导Ⅰ型干扰素表达的能力,决定其宿主适应性的差异。为解析在水禽宿主中诱导Ⅰ型干扰素表达差异的分子机制,我们比较了50株GⅠ型与GⅢ型JEV的全基因组序列,找到了53个具有高度替换率的差异性氨基酸位点,利用建立的PCR-Based反向遗传学系统构建了GⅠ型与GⅢ型JEV间结构蛋白和各个非结构蛋白相互替换的嵌合病毒,结果发现结构蛋白的相互替换并没有改变GⅠ型与GⅢ型病毒的特性,但当非结构蛋白NS5相互替换后,具有GI-NS5蛋白的嵌合病毒rGIII/SH7NS5与亲本毒rGI相似,能够诱导更低水平的IFN-α与IFN-β表达,并且具有复制动力学的优势,同时发现GI-NS5蛋白相对于GIII-NS5蛋白具有更强的拮抗Ⅰ型干扰素表达的能力。而GⅠ型与GⅢ型NS5蛋白间共存在11个氨基酸位点的差异且分布在三个结构域上,进一步构建了NS5蛋白各个结构域相互替换的嵌合病毒,发现NS5蛋白a-a RdRp区域决定着病毒诱导IFN-α与IFN-β的表达能力,具有该区域的嵌合病毒rGI/SH7b-aRdRp、rGIII/SH7a-aRdRp与亲本毒rGI相似,在DEF细胞中能够诱导低水平IFN-α与IFN-β的表达,并且病毒的复制水平更高。NS5蛋白a-aRd Rp区域共存在V372A与H386Y两个氨基酸位点的差异,V372与H386氨基酸位点在GI毒株中高度保守,但A372与Y386氨基酸位点在GⅢ型毒株中保守性较差。为探究关键性的氨基酸位点,构建了V372A或H386Y氨基酸位点的突变病毒,最终发现只有当GⅠ型或GⅢ型JEV NS5蛋白同时存在氨基酸V372与H386时,才能在水禽宿主中具有诱导低水平IFN-α与IFN-β表达的能力,并表现出宿主适应性的优势。NS5-V372A与H386Y两个氨基酸位点位于NLS区域,该区域属于一种核定位信号并与NS5蛋白拮抗Ⅰ型干扰素能力相关。而V372A与H386Y两个氨基酸位点决定着NS5蛋白的入核能力,通过实验发现GI-NS5蛋白具有与核转运受体蛋白du KPNA4更强的结合能力,但同时duKPNA4也可与Ⅰ型干扰素转录因子duIRF7结合,这使得GI-NS5蛋白与du IRF7竞争结合duKPNA4的能力更强,从而抑制duIRF7入核起始Ⅰ型干扰素的表达,这也就导致了具有NS5-V372-H386的突变病毒与亲本毒rGI能够诱导低水平IFN-α与IFN-β表达的能力。那么,为什么两个氨基酸位点决定着NS5蛋白与duKPNA4的结合能力?利用生物信息学软件分析了两个氨基酸位点在NS5蛋白空间结构上的特点,发现V372A与H386Y各个氨基酸位点形成的氢键排布不同,这可能导致NS5蛋白的NLS柔韧性有所不同。为验证假设,将GⅠ型与GⅢ型NS5-372与-386氨基酸位点进行同性氨基酸替代,结果发现与亲本毒rGI的NS5-372-386位点具有相同氢键特性的突变病毒rGI/V372G-H386K,rGI/V372P-H386R,rGIII/A372G-Y386K和rGIII/A372P-Y386R,其NS5蛋白具有更强的入核能力,能够诱导低水平IFN-α与IFN-β的表达,并表现出对水禽宿主适应性的优势。综上所述,本研究成功的构建了GⅠ型与GⅢ型JEV PCR-Based反向遗传学系统,并以此为基础构建了一系列的嵌合病毒与定点突变病毒,最终找到NS5-V372A-H386Y两个氨基酸位点决定着GⅠ型与GⅢ型JEV对水禽宿主适应性的差异。进一步的研究发现NS5-V372A-H386Y位点决定着NS5蛋白与duIRF7竞争结合duKPNA4的能力,从而影响Ⅰ型干扰素的表达。同时,通过对GI-NS5与GIII-NS5蛋白进行结构模拟分析,发现NS5-V372A与H386Y两个氨基酸位点的氢键排布决定着宿主适应性的差异,并通过对V372A与H386Y位点进行同性氨基酸的替换得到了验证。因此,本研究中从病毒与宿主两个方面解释了GⅠ型与GⅢ型JEV对水禽具有宿主适应性差异的原因,这为进一步揭示JEV基因型转换的分子机制奠定了理论基础。