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目的:研究在人胆管癌细胞中GSK-3β抑制多柔比星杀伤作用的分子机制;方法:本实验分别在QBC939和RBE两种胆管癌细胞中使用（1）多柔比星单独处理细胞;（2）GSK-3β的两种抑制剂CHIR99021、6-bromoindirubin-3’-oxime（BIO）单独或与多柔比星联合处理细胞;（3）PI3K抑制剂LY294002、PI828、Wortmannin单独或与多柔比星联合处理细胞;（4）FAK抑制剂PF-573228单独或与多柔比星联合处理细胞;（5）mTOR抑制剂Rapamycin（Rap）/AZD8055、PDK1抑制剂OSU-03012单独或与转染myr-HA-AKT过表达质粒联合处理细胞;（6）转染siRNA干扰GSK-3β、PDK1、Rictor的表达。对以上各处理组的细胞使用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒、蛋白免疫印迹实验、实时荧光定量PCR及PI3K激酶活性试剂盒分别检测细胞死亡率（%）、细胞凋亡及FAK/AKT等信号通路的相关分子——PARP、FAK、AKT、S6等蛋白的表达水平、GSK-3β的mRNA表达水平以及PI3K活性。结果:（1）抑制AKT信号通路减弱多柔比星杀伤胆管癌细胞:（1）多柔比星抑制胆管癌细胞中AKT蛋白活化:多柔比星处理两种胆管癌细胞不同时间后,细胞蛋白免疫印迹实验检测p-AKTS473和及其经典下游分子p-S6蛋白的表达出现明显下调现象,表明多柔比星较为明显地抑制了胆管癌细胞中的AKT蛋白的活化;（2）抑制AKT信号通路促进多柔比星引起胆管癌细胞死亡:使用AKT上游调控因子PI3K的两种抑制剂LY29004或PI828与多柔比星单独或联合处理两种胆管癌细胞系,Western blot结果显示联合处理比单独多柔比星处理细胞的PARP剪切条带明显增强;且乳酸脱氢酶细胞毒性检测细胞死亡率与Western blot结果一致,表明AKT信号通路保护胆管癌细胞免受多柔比星引起的细胞死亡;（2）GSK-3β通过AKT信号通路影响多柔比星杀伤胆管癌细胞:（1）多柔比星不影响胆管癌细胞中的GSK-3β蛋白活化:在两种胆管癌细胞中使用多柔比星处理细胞后检测出p-GSK-3βY216的表达无明显变化,表明在多柔比星处理下GSK-3β的活化无明显变化;α抑制GSK-3β活化增强多柔比星杀伤胆管癌细胞:使用GSK-3β的抑制剂抑制其活化或GSK-3βsiRNA干扰GSK-3β表达后与多柔比星联用,Western blot结果显示PARP剪切条带明显比单独多柔比星处理组有所增加,且乳酸脱氢酶细胞毒性检测的细胞死亡率结果与Western blot结果一致,表明抑制GSK-3β能增强多柔比星对胆管癌的敏感性;（3）抑制GSK-3β活性导致AKT信号通路失活:为了验证GSK-3β是否调控ΑΚΤ信号通路,本实验使用GSK-3β抑制剂抑制其活性或GSK-3βsiRNA干扰GSK-3β表达后与多柔比星联用,Western blot结果显示抑制GSK-3β可以明显抑制AKT T308和S473位点的磷酸化;（3）在胆管癌细胞中GSK-3β对AKT调控不依赖PDK1、mTORC2及PI3K:（1）在胆管癌细胞中GSK-3β对AKT T308的调控不依赖PDK1:虽然使用PDK1抑制剂或siPDK1 RNA处理未转染或转染了myr-HA-AKT的胆管癌细胞后能明显抑制AKT T308位点的磷酸化,但是GSK-3β抑制剂抑制其活性或GSK-3βsiRNA干扰GSK-3β表达后胆管癌细胞中的p-PDK1表达并无明显变化,表明GSK-3β在胆管癌细胞中对AKT T308的调控不通过PDK1;（2）在胆管细胞中GSK-3β对AKT S473的调控不依赖mTORC2:虽然使用mTORC2抑制剂或siRictor RNA处理未转染或转染了myr-HA-AKT的胆管癌细胞后能明显抑制AKT S473位点的磷酸化,但是GSK-3β抑制剂抑制其活性或GSK-3βsiRNA干扰GSK-3β表达后胆管癌细胞中的mTORC2经典下游分子PKC的磷酸化水平并无明显变化,表明GSK-3β在胆管癌细胞中对AKT调控不通过mTORC2;（3）在胆管癌细胞中GSK-3β对AKT调控不依赖PI3K:使用GSK-3β抑制剂抑制其活性后,PI3K激酶活性检测结果表明GSK-3β不影响PI3K活性;（4）在胆管癌细胞中GSK-3β对AKT的调控依赖FAK:（1）在胆管癌细胞中FAK调控AKT不依赖PI3K:使用FAK抑制剂处理未转染或转染了myr-HA-AKT的胆管癌细胞后能明显抑制AKT的磷酸化水平,且PI3K激酶活性检测结果显示FAK抑制剂不影响PI3K活性;（2）在胆管癌细胞中GSK-3β调控胆管癌细胞中的FAK磷酸化:使用GSK-3β抑制剂抑制其活性或GSK-3βsiRNA干扰GSK-3β表达后单独或与多柔比星联用处理细胞,Western blot结果表明抑制GSK-3β可以抑制FAK T397和T576/577位点的磷酸化;（3）FAK/AKT抑制多柔比星杀伤胆管癌细胞:多柔比星单独或联合FAK抑制剂处理胆管癌细胞,Western blot和乳酸脱氢酶细胞毒性检测结果都表明抑制FAK可以增强多柔比星对胆管癌细胞的敏感性;综合以上结果表明GSK-3β通过不依赖PI3K的方式调控FAK/AKT信号通路从而保护胆管癌细胞免受多柔比星的杀伤作用。结论:1.抑制AKT信号通路减弱多柔比星杀伤胆管癌细胞;2.GSK-3β通过AKT信号通路影响多柔比星杀伤胆管癌细胞;3.在胆管癌细胞中GSK-3β对AKT调控不依赖PDK1、mTORC2及PI3K;4.在胆管癌细胞中GSK-3β对AKT的调控依赖FAK。